Papel del factor de crecimiento transformante beta (tgf-b) y eficacia de moléculas inhibidoras en la respuesta inflamatoria de la superficie ocular

Abstract

OBJETIVO: El objetivo del presente trabajo de investigación ha sido profundizar en el conocimiento acerca de la participación del epitelio de la superficie ocular durante el desarrollo de los procesos inflamatorios crónico-severos que pueden conducir a la pérdida de visión; en particular, el objetivo ha sido tratar de dilucidar la implicación del TGF-b en dichos procesos, determinando: 1) si la células de la superficie ocular son una posible fuente de TGF-b y 2) los efectos que esta molécula produce sobre las células. El fin último de este estudio es diseñar nuevas vías terapéuticas en los que la célula epitelial sea la diana principal; de esta manera, se podrá controlar y evitar la contribución de dichas células al proceso de iniciación y/o propagación del proceso inflamatorio, evitando así posiblemente la cronicidad del mismo. MATERIALES Y MÉTODOS: Para la realización del presente estudio se emplearon 1) la línea celular HCE de epitelio corneal humano y 2) la línea celular IOBA-NHC derivada de epitelio conjuntival humano. La secreción de las isoformas de TGF-b y la expresión de los receptores de TGF-b se determinaron en condiciones basales y en células expuestas a citoquinas tipo Th1 (IFN-g), tipo Th2 (IL-4 e IL-13), tipo Th17 (IL-17) y la citoquina proinflamatoria TNF-a dada la alta implicación de dichas moléculas en procesos de inflamación crónica-grave de la superficie ocular. Las células también se expusieron in vitro a TGF-b1 y TGF-b2 en presencia y/o ausencia de dos moléculas anti TGF-b (P17 y P144) y se analizó la activación de transducción de señales implicadas en las respuestas a TGF-b (pSMAD-2 y SMAD-7), la activación de otras vías de señalización implicadas en respuestas a otros estímulos inflamatorios (pSTAT-1/STAT-1, pSTAT-6/STAT6, pIkBa/IkBa), la modificación por TGF-b de la expresión de receptores para diferentes moléculas implicadas en respuestas inflamatorias (TLR-4 e IL-17), y la secreción celular (de 22 citoquinas/ quimioquinas, de la molécula inhibidora SLPI, de TSLP y de 4 metaloproteinasas). Finalmente se analizó el efecto del TGF-b en la transición epitelio-mesenquimal en estos tipos celulares de la superficie ocular. RESULTADOS: Ambos tipos celulares, corneales y conjuntivales secretan basalmente in vitro TGF-b; las células IOBA-NHC secretaron principalmente TGF-b1, y las HCE principalmente TGF-b2. Observamos que en condiciones inflamatorias, esta secreción se modificaba: el TNF-a incrementaba significativamente la secreción de TGF-b2 en células HCE (tanto de la forma latente como de la forma activa) y que IL-17 incrementaba la secreción de la forma activa de TGF-b2 en células HCE. Tanto las células epiteliales corneales como conjuntivales expresan basalmente receptores de TGF-b RI, RII y RIII. En condiciones inflamatorias, la expresión de estos receptores se modificó, observándose: una disminución de la expresión de TGF-b RI tras la estimulación con IL-4, un incremento de RII tras la estimulación con TNF-a y de RI con IL-17 en células epiteliales corneales, así como un incremento en células IOBA-NHC de la expresión de RI tras la exposición a IL-17 y de RIII con TNF-a e IFN-g Los receptores de TGF-b expresados son funcionales ya que el TGF-b incrementó la fosforilación y traslocación nuclear de SMAD-2 en ambos tipos celulares. El TGF-b1 disminuyó la expresión de SMAD-7 en las células IOBA-NHC. Las células HCE e IOBA-NHC expresan basalmente el receptor tipo Toll TLR-4 y el receptor para IL-17 (IL-17R). El tratamiento celular con la isoforma TGF-b2 inhibió la expresión del TLR-4 en las células HCE e IOBA-NHC mientras que el TGF-b1 lo hacía en las IOBA-NHC únicamente. Tanto TGF-b1 como TGF-b2 incrementaron la expresión de IL-17R en las células IOBA-NHC. La exposición a TGF-b modificó la secreción de citoquinas y quimioquinas por las células epiteliales corneales y conjuntivales cultivadas. El efecto observado fue dependiente del tipo celular (corneal o conjuntival) y la isoforma de TGF-b (b1 o b2) usado para la estimulación. La estimulación con TGF-b aumentó significativamente la secreción de GM-CSF, IL-2, IL-12p40, IL-6 e IL-10 por células epiteliales corneales HCE y de GM-CSF e IL-8 por células epiteliales conjuntivales IOBA-NHC. Además, la estimulación con TGF-b disminuyó significativamente la secreción de RANTES en ambas líneas celulares e IP-10 en células epiteliales conjuntivales. Además, en células epiteliales corneales el tratamiento con las isoformas TGF-b1 y TGF-b2, incrementó significativamente la secreción de MMP-1, MMP-9 y MMP-13, así como la transición epitelio mesenquimal. Respecto al efecto de las moléculas inhibidoras de TGF-b P144 y P17, observamos que P144 disminuía la secreción basal y la estimulada por TGF-b de varias citoquinas y quimioquinas relacionadas con procesos inflamatorios, tales como GM-CSF, IP-10, Il-6, IL-8 y RANTES. Además, P144 inhibió significativamente la secreción de MMP-13 estimulada por TGF-b1, aunque no la estimulada por TGF-b2; tampoco observamos ningún efecto de los péptidos en la secreción de MMP-9 estimulado por TGF-a. A nivel de transducción de señales, observamos que P144 disminuyó la expresión de pSMAD-2. Por su parte, la molécula P17 mostró un efecto inhibitorio en el proceso de la transición epitelio-mesenquimal activada por TGF-b1 en células corneales. El tratamiento con las moléculas P144 y P17 no provocó un efecto de recuperación de los niveles de expresión de TLR-4 ni de secreción de SLPI inhibidos por TGF-b. CONCLUSIÓN Este estudio refuerza la relevancia del TGF-b en inflamación de la superficie ocular. Los resultados sugieren que TGF-b podría tener un papel importante en las respuestas inflamatorias locales de las células epiteliales de la superficie ocular a través de la regulación de secreción de citoquinas y quimioquinas, la producción de la molécula inhibidora SLPI y/o metaloproteinasas entre otros mecanismos. A través de la secreción de citoquinas/quimioquinas y del TGF-b, las células epiteliales de la superficie ocular podrían participar localmente en la diferenciación de linfocitos al subtipo Th17. Algunas de las respuestas de las células epiteliales conjuntivales y corneales observadas in vitro fueron parcialmente revertidas por moléculas anti-TGF-b, sugiriendo que la regulación de la expresión local de TGF-b podría ser una buena nueva propuesta terapéutica para las enfermedades inflamatorias de la superficie ocular.