Lazarillo and related lipocalinsligands and functions

Resumen

Lazarillo (Laz) de saltamontes, Lazarillo Glial (GLaz) y Lazarillo Neural (NLaz) de Drosophila, y Apolipoproteina D (ApoD) de vertebrados, son proteínas homólogas pertenecientes a la familia de las Lipocalinas. Funcionalmente se han asociado con un papel protector frente al estrés oxidativo y al envejecimiento [1-6]. Además tienen un papel activo en la regulación del metabolismo [4,5,7-9]. La familia de las Lipocalinas está presente en todos los reinos. Sus miembros tienen entre 160 y 230 aminoácidos y son secretados al espacio extracelular. Los integrantes de la familia típicamente presentan una baja identidad de secuencia, pero sin embargo una alta conservación en su estructura terciaria. El plegamiento de las Lipocalinas se caracteriza por un barril-ß que forma una cavidad o bolsillo donde se van a unir pequeños compuestos o ligandos, que serán habitualmente de carácter hidrofóbico. El ligando (o ligandos) es un elemento clave en las Lipocalinas y habitualmente define sus funciones biológicas. Es frecuente encontrar que muchos miembros de la familia presentan un amplio espectro de ligandos y por tanto están implicados en múltiples procesos biológicos [10]. El estudio de la filogenia de las Lipocalinas integra a Laz y a las Lipocalinas relacionadas (GLaz, NLaz y ApoD) en el clado I del árbol filogenético de proteínas. El clado I por tanto se convierte en punto de unión de las Lipocalinas de invertebrados y vertebrados [11-13]. En esta tesis he estudiado a la Lipocalina Lazarillo y a sus homólogos como grupo. La identificación de sus ligandos y su influencia en las funciones que llevan a cabo es el objetivo global de esta tesis. Para alcanzar este objetivo global se desarrollaron cuatro objetivos concretos que han sido resumidos anteriormente junto a los resultados, estos últimos organizados según los capítulos en que se organiza esta tesis. Para la consecución del objetivo global he empleado distintos niveles de aproximación experimental: 1) Ensayos in vitro: expresión génica, medidas de peroxidación lipídica, medidas de triglicéridos y glucosa, ensayos de unión ligando-proteína, etc. 2) Cultivos celulares: neuroblastomas humanos y líneas celulares de Drosophila. 3) Ensayos in vivo utilizando Drosophila melanogaster como organismo modelo. Entre los ensayos in vivo se incluyen estudios de longevidad, resistencia a estrés, análisis del comportamiento, etc. El primer objetivo específico (objetivo 1) consistió en la caracterización de las funciones biológicas en que están implicadas las Lipocalinas de Drosophila GLaz y NLaz. Para ello se utilizaron mutantes nulos de GLaz o NLaz y se estudió qué fenotipos están alterados, prestando especial atención a su relación con el envejecimiento y a los dimorfismos sexuales. La ausencia de NLaz reduce la supervivencia en machos y en hembras. Sin embargo, la falta de GLaz reduce la longevidad en machos, pero no en hembras. El análisis de los mutantes revela que los cambios en la homeostasis de proteínas son los responsables de las diferencias observadas en longevidad. Tanto GLaz como NLaz están implicadas en la respuesta a estrés y el control de lípidos peroxidados, sin embargo, los ensayos de comportamiento y el almacenaje de grasas a los largo del tiempo diferencian a los mutantes de GLaz y NLaz. Por tanto se observa una división parcial de trabajos entre GLaz y NLaz. Dado que el ligando es el responsable de muchas de las funciones que llevan a cabo las Lipocalinas, en el objetivo 2 estudié las capacidad de unión de Laz, NLaz y ApoD. Para ello, cloné estas Lipocalinas en un sistema de expresión en células S2 de Drosophila, las purifiqué, y las enfrenté a una batería de posibles ligandos. La capacidad de unión fue monitorizada mediante fluorimetría. Laz, NLaz y ApoD son capaces de unir ligandos hidrofóbicos dentro un gran rango de estructuras y tamaños, pero a su vez muestran una alta especificidad. Por ejemplo, ApoD une selectivamente el cannabinoide anandamida y NLaz une específicamente la feromona 7-T. Por otra parte, ApoD, NLaz y Laz presentan ligandos en común, como es el caso del ácido retinoico o la esfingomielina. En el objetivo 3 estudié in vivo la relevancia de la unión de los ligandos. Para ello diseñé una serie de mutaciones puntuales en la secuencia de NLaz que podrían alterar la capacidad de unión a ligandos. En concreto, la mutación L130R elimina la unión in vitro del ergosterol y la feromona 7-T a NLaz. El estudio in vivo de los mutantes puntuales L130R mostró que, en muchos fenotipos, se asemejan más a individuos mutantes nulos para NLaz que a individuos silvestres. Los fenotipos en los que se observó este patrón incluyen la regulación de la longevidad, la respuesta a estrés, las habilidades comportamentales (test de escalada y de cortejo) y, por último, el almacenaje de triglicéridos. Sin embargo, la homeostasis de la glucosa no se vio alterada por la pérdida de la capacidad de unión a ligandos de NLazL130R. En el último objetivo específico (objetivo 4), me planteé si estas Lipocalinas pueden llevar a cabo sus funciones protectoras desde otra localización sub-celular. La Lipocalina escogida fue Laz, ya que Laz de saltamontes en su contexto natural presenta la exclusividad de aparecer unida a la membrana plasmática mediante una cola GPI. Mediante transgénesis obtuve moscas que expresan Laz anclado a la membrana plasmática. Estos individuos, mostraron una mayor resistencia a distintas formas de estrés y una longevidad incrementada. Por tanto, las funciones protectoras de este grupo de Lipocalinas pueden ser ejercidas desde la membrana. Sin embargo, la presencia de Laz en individuos deficientes en NLaz no fue capaz de restaurar el fenotipo silvestre en los ensayos de cortejo. En este último caso sí que es necesario la presencia de la proteína libre, probablemente debido a que es necesario el transporte del ligando. De todos estos resultados se concluye que Laz y las Lipocalinas relacionadas están implicadas en un gran número de procesos biológicos, jugando tanto su localización sub-celular como el ligando un papel fundamental en la correcta ejecución de sus funciones. Referencias 1. Bajo-Graneras R, Ganfornina MD, Martin-Tejedor E, Sanchez D (2011) Apolipoprotein D mediates autocrine protection of astrocytes and controls their reactivity level, contributing to the functional maintenance of paraquat-challenged dopaminergic systems. Glia 59: 1551-1566. 2. Bajo-Graneras R, Sanchez D, Gutierrez G, Gonzalez C, Do Carmo S, et al. (2011) Apolipoprotein D alters the early transcriptional response to oxidative stress in the adult cerebellum. J Neurochem 117: 949-960. 3. Ganfornina MD, Do Carmo S, Lora JM, Torres-Schumann S, Vogel M, et al. (2008) Apolipoprotein D is involved in the mechanisms regulating protection from oxidative stress. Aging Cell 7: 506-515. 4. Hull-Thompson J, Muffat J, Sanchez D, Walker DW, Benzer S, et al. (2009) Control of metabolic homeostasis by stress signaling is mediated by the lipocalin NLaz. PLoS Genet 5: e1000460. 5. Sanchez D, Lopez-Arias B, Torroja L, Canal I, Wang X, et al. (2006) Loss of glial lazarillo, a homolog of apolipoprotein D, reduces lifespan and stress resistance in Drosophila. Curr Biol 16: 680-686. 6. Walker DW, Muffat J, Rundel C, Benzer S (2006) Overexpression of a Drosophila Homolog of Apolipoprotein D Leads to Increased Stress Resistance and Extended Lifespan. Current Biology 16: 674-679. 7. Do Carmo S, Fournier D, Mounier C, Rassart E (2009) Human apolipoprotein D overexpression in transgenic mice induces insulin resistance and alters lipid metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab 296: E802-811. 8. Jimenez-Palomares M, Cozar-Castellano I, Ganfornina MD, Sanchez D, Perdomo G (2011) Genetic deficiency of apolipoprotein D in the mouse is associated with nonfasting hypertriglyceridemia and hyperinsulinemia. Metabolism 60: 1767-1774. 9. Pasco MY, Leopold P (2012) High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PLoS One 7: e36583. 10. Akerström B, Borregaard N, Flover D, Salier J (2006) Lipocalins. Georgetown, Texas. 204 p. 11. Ganfornina M, Sanchez D, Greene L, Flover D (2006) The Lipocalin Protein Family: Protein Sequence, Structure and Relationship to the Calycin Superfamily. In: Akerstrom B, Borregaard N, Flower D, Salier J, editors. Lipocalins. 1st Edition ed. Georgetown, Texas: Landes Bioscience. pp. 17-27. 12. Ganfornina MD, Gutierrez G, Bastiani M, Sanchez D (2000) A phylogenetic analysis of the lipocalin protein family. Mol Biol Evol 17: 114-126. 13. Gutierrez G, Ganfornina MD, Sanchez D (2000) Evolution of the lipocalin family as inferred from a protein sequence phylogeny. Biochim Biophys Acta 1482: 35-45.