Estrategias alternativas para la bioconjugación de ocratoxina a y su aplicación en inmunodiagnóstico alimentario

Resumen

Ocratoxina A (OTA) es un metabolito secundario producido por hongos del género Aspergillus y Penicillium. Esta micotoxina puede encontrarse en una gran variedad de alimentos, entre los que se encuentran cereales, café o vino. OTA es un potente carcinógeno en roedores, motivo por el que se encuentra clasificado en el grupo 2B (posible carcinógeno para humanos) por la Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer. Con el objetivo de reducir la exposición de los consumidores a esta micotoxina, la Comisión Europea ha establecido concentraciones máximas en varias matrices alimentarias, siendo este límite de 2 µg/L en el caso de vino y zumo de uva. Entre las diferentes técnicas analíticas para la detección de OTA, los métodos ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) y los ensayos de flujo lateral (LFIA, Lateral Flow ImmunoAssay) son métodos ampliamente utilizados debido a su simplicidad, bajo coste, portabilidad y alta capacidad de análisis. Se ha publicado en la literatura científica un gran número de inmunoensayos para la detección de OTA, pero en todos ellos los conjugados empleados, tanto de inmunización como de ensayo, fueron preparados mediante el acoplamiento directo de esta micotoxina a proteínas empleando el grupo carboxilo presente en su estructura. La presente Tesis Doctoral se ha centrado en la síntesis de nuevos derivados funcionalizados de ocratoxina A (haptenos) y en el uso de los mismos para el desarrollo de inmunoensayos que permitan la detección de esta micotoxina en alimentos con elevada sensibilidad y especificidad. Los nuevos haptenos fueron químicamente sintetizados manteniendo libre el grupo carboxilo de la toxina, con el objetivo de que este pudiese participar en la interacción antígeno–anticuerpo. La hipótesis de partida planteaba que la presencia de dicho grupo en los conjugados destinados a inmunización de animales de laboratorio permitiría la producción de anticuerpos con mejores prestaciones analíticas. Dos de estos haptenos fueron preparados con grupos carboxilo en posiciones distales de la estructura de OTA, manteniendo libre el carboxilo propio de la toxina. Además, se prepararon dos haptenos con un grupo azida en el extremo del brazo espaciador con el objetivo de evaluar la viabilidad de la generación de anticuerpos a partir de conjugados proteicos obtenidos a través de una reacción de cicloadición de Huisgen 1,3-dipolar catalizada por cobre (I) (CuAAC), el ejemplo clásico de reacción “click”. La importancia del grupo carboxilo nativo de OTA se confirmó mediante la evaluación de anticuerpos policlonales de conejo. Los antisueros producidos a partir de haptenos con dicho grupo carboxilo libre mostraron afinidades hacia OTA superiores a aquellos que se obtuvieron a partir de conjugados preparados a través del mismo. Además, se obtuvo una buena respuesta inmune a partir de los bioconjugados preparados mediante química “click”, demostrando que la presencia del anillo de triazol en el brazo espaciador producto del acoplamiento no impide la generación de anticuerpos de elevada afinidad. Finalmente, se llevó a cabo la producción de anticuerpos monoclonales de ratón a partir de todos los haptenos sintetizados y, tras su caracterización mediante ELISA competitivo, las mejores combinaciones de inmunorreactivos se utilizaron para el desarrollo de un ELISA y de tiras inmunorreactivas para la detección de OTA en vino y zumo de uva. Las características analíticas de los ensayos desarrollados fueron similares o superiores a los kits comerciales evaluados.