Implicación del proceso de splicing alternativo en el desarrollo de hepatocarcinoma

Resumen

1. introducción o motivación de la tesis El cáncer de hígado representa una patología compleja y heterogénea que engloba varios tipos de tumores malignos con características y pronóstico desfavorables, entre los que se encuentra el carcinoma hepatocelular o hepatocarcinoma (HCC)[1, 2]. El HCC es uno de los tipos de cáncer con peor pronóstico, y mayor incidencia y mortalidad en el mundo[3, 4]. A pesar de la intensa caracterización y los importantes avances realizados en esta patología tumoral gracias a los resultados obtenidos por la investigación durante años, las estrategias diagnósticas y terapéuticas en el HCC no son del todo efectivas[5, 6]. Por lo tanto, existe la necesidad de encontrar elementos o perfiles moleculares comunes que faciliten estrategias diagnósticas y terapéuticas integrales y efectivas, y que puedan mejorar el pronóstico en esta devastadora patología. En este sentido, hace algunos años se propusieron diez características comunes que comparten la mayoría de tipos de cáncer[7]. Cada una de estas características distintivas del cáncer parece estar asociada con alteraciones concretas en el proceso de splicing, lo que a su vez conduce a un fenotipo de cáncer más agresivo e invasivo[8]. Por ello, el proceso de splicing ha surgido como una alternativa prometedora para la identificación de nuevos biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de diversas patologías metabólicas y numerosos tipos de cáncer[9], así como una posible fuente para la identificación de posibles dianas terapéuticas en el tratamiento del HCC. El proceso de splicing es catalizado y regulado por una intrincada maquinaria intracelular compuesta por diferentes complejos macromoleculares de ribonucleoproteínas (RNP), llamado spliceosoma y regulado por más de 300 factores de splicing[10, 11]. Estudios recientes han revelado que existe una relación entre la desregulación de esta maquinaria celular y diferentes patologías tumorales[12, 13]. Sin embargo, aún no se conoce con exactitud el papel de los componentes del spliceosoma y los factores de splicing en el desarrollo y/o progresión del HCC. Por todas estas razones, el objetivo principal de esta Tesis fue determinar el grado de desregulación y el posible papel de la maquinaria que controla el proceso de splicing en HCC, así como los mecanismos reguladores subyacentes, con el fin de encontrar nuevos biomarcadores y dianas farmacológicas con potencial para mejorar los enfoques diagnósticos y terapéuticos en esta patología. 2.contenido de la investigación En primer lugar, se realizó un estudio del perfil de expresión génica de un grupo amplio y representativo de componentes del spliceosoma y factores de splicing que permitió observar una profunda desregulación de esta maquinaria en HCC. Un análisis más profundo por VIP Score (PLS-DA) mostró cambios de expresión relevantes entre tejido tumoral y tejido adyacente no tumoral de elementos clave para el funcionamiento del spliceosoma como SF3B1 o PRPF8 y de otros factores importantes como KHDRBS3, ESRP2, EIF4A3, o SRPK1. Estos resultados nos llevaron a estudiar más en profundidad la desregulación y el papel de SF3B1 y PRPF8 debido a la existencia de fármacos dirigidos a estos factores, su importancia en el funcionamiento del spliceosoma y/o su papel en otras patologías. Así, la primera sección experimental de esta Tesis tuvo como objetivo estudiar el papel de SF3B1 (splicing factor 3 subunit 1) en HCC, con el fin de explorar su potencial como biomarcador y/o diana terapéutica en esta patología. En primer lugar, los análisis de expresión revelaron que SF3B1 está sobreexpresado (a nivel de ARN y proteína) en HCC en dos cohortes retrospectivas y en cinco cohortes in silico, y que su expresión está asociada con la agresividad tumoral, la expresión de variantes de splicing oncogénico (KLF6-SV1, BCL -XL) y la disminución de la supervivencia general de los pacientes. De hecho, in vitro, el silenciamiento de SF3B1 redujo la viabilidad, la proliferación y la migración celular y su bloqueo farmacológico con pladienolide-B inhibió la proliferación, migración y formación de tumorosferas y colonias en las tres líneas celulares de cáncer de hígado usadas (HepG2, Hep3B, SNU-387), mientras que los efectos sobre la proliferación de la línea celular derivada de hepatocitos normales (THLE-2) fueron imperceptibles. Pladienolide-B también redujo el crecimiento in vivo y la expresión de marcadores tumorales en tumores xenógrafos inducidos por células Hep3B en ratones atímicos. Además, el silenciamiento y/o bloqueo de SF3B1 moduló la activación de vías de señalización clave (PDK1, GSK3b, ERK, JNK, AMPK), y la expresión de genes asociados al cáncer (CDK4, CD24), así como variantes de splicing oncogénicas (KLF6-SV1). En la segunda sección experimental de esta Tesis nuestro objetivo fue estudiar la desregulación de la expresión de PRPF8 y su posible papel funcional en el HCC. Primero, se analizó la expresión de PRPF8 (a nivel de ARNm / proteína) en una cohorte retrospectiva de pacientes con HCC [y se validó en dos cohortes in silico (TCGA y CPTAC)]. Los resultados indicaron que PRPF8 se sobreexpresa en HCC y se asocia con una mayor agresividad tumoral (supervivencia del paciente, etc.), con la expresión de variantes de splicing de HCC y la modulación de genes críticos implicados en vías relacionadas con el cáncer. El silenciamiento de PRPF8 redujo la agresividad in vitro y disminuyó el crecimiento tumoral in vivo. Los datos de CLIPseq en HepG2 demostraron que PRPF8 se une preferentemente a exones de genes que codifican proteínas, y análisis de RNAseq mostró que el silenciamiento de PRPF8 altera los eventos de splicing de múltiples genes. El análisis integrado reveló que el silenciamiento de PRPF8 modula el splicing de fibronectina (FN1), lo que promueve la exclusión del exón 40.2, que es fundamental para que la FN1 pueda unirse a las integrinas. En concordancia con esto, el silenciamiento de PRPF8 redujo la fosforilación de FAK/AKT y la formación de fibras de estrés. De hecho, las células HepG2 y Hep3B mostraron una menor capacidad invasiva en las membranas tratadas con medios de células silenciadas con siPRPF8, en comparación con las células control. Por último, en la tercera sección experimental se analizó más en profundidad el resto de los factores. Este análisis mostró que la expresión del 42% de los componentes del spliceosoma y factores de splicing analizados estaba significativamente desregulada (a nivel de ARNm) en la cohorte retrospectiva de pacientes con HCC (n=86), lo que se validó, de manera muy consistente en 7 cohortes adicionales (retrospectivas o in silico). Concretamente, EIF4A3, RBM3, ESRP2 y SRPK1 fueron los factores de splicing con mayor capacidad de discriminación (o mayor valor de cambio) entre muestras tumorales y no tumorales. De ellos, la expresión de EIF4A3 fue la que presentó una asociación más sólida con la disminución de la supervivencia general, una mayor recurrencia y con otras características clínicas. Además, el silenciamiento de EIF4A3 in vitro redujo la proliferación, la migración, la formación de tumores y colonias en tres líneas celulares de cáncer de hígado (HepG2, Hep3B y SNU-387). De igual forma, el silenciamiento in vivo de este factor en tumores xenógrafos establecidos en ratones atímicos redujo el crecimiento de tumores inducidos por células Hep3B. Por otro lado, el silenciamiento de EIF4A3 sensibilizó a las células de cáncer de hígado (HepG2, Hep3B y SNU-387) frente a algunos fármacos utilizados para el HCC como Sunitinib y Lenvatinib, ya que la proliferación celular se redujo más en las células con silenciamiento de EIF4A3 que en las células control en respuesta a estos fármacos. Finalmente, los datos de RNAseq mostraron que el silenciamiento de EIF4A3 provoca la alteración de la expresión y el splicing de genes clave en el HCC, como FGFR4. De hecho, estudios in silico e in vitro demostraron que EIF4A3 es un factor fundamental para el correcto splicing de FGFR4, de manera que el silenciamiento de EIF4A3 alteran el patrón de splicing de este gen y compromete la respuesta celular a FGF19, el ligando natural de FGFR4. 3.conclusión Por todo lo indicado, los estudios desarrollados en la presente Tesis permiten ampliar y avanzar en el conocimiento de las bases moleculares de la regulación fisiopatológica del HCC a través del estudio de la maquinaria de splicing. Específicamente, nuestros resultados demuestran que esta maquinaria celular está desregulada en el HCC y podría representar puntos de regulación relevantes para estos tumores y, por lo tanto, podrían ser herramientas útiles para el desarrollo de nuevos biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y/o dianas terapéuticas (como EIF4A3, SF3B1, PRPF8, ESRP2, SRPK1 o RBM3) para mejorar el tratamiento futuro de esta patología. 4. bibliografía 1. 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