Application of cytogenetic tools for studying chromosome associations in meiosis for plant breeding purposes

Laburpena

1. Introducción o motivación de la tesis El trigo es uno de los cultivos más importantes a nivel mundial, ocupando el tercer puesto después del maíz y el arroz, con una producción de más de 734 millones de toneladas anuales (FAO-STAT 2020; http://faostat.org), pero a su vez es el cultivo con mayor área cultivada a nivel mundial. Esta amplia distribución en zonas templadas y subtropicales es consecuencia de su buena adaptabilidad a distintos ambientes. El trigo tiene unas cualidades alimentarias que le hacen ser el idóneo como fuente principal de energía (carbohidratos, proteínas y fibra dietética) en muchas sociedades, ya que su alto rendimiento y versatilidad permiten fabricar una gran variedad de productos de consumo diario como pan, galletas, pasta, pasteles, etc… El trigo empezó a cultivarse hace unos 10.000 años cuando el ser humano dejó el nomadismo para asentarse y empezar a cultivar, esto tuvo como consecuencia una gran evolución en las sociedades. La domesticación del trigo se produjo durante esta época, la llamada “revolución neolítica” y fue después de varias rondas de hibridación espontanea del trigo tetraploide junto con un donador, cuando se empezó a cultivar el trigo hexaploide o harinero. El trigo harinero está compuesto por tres genomas, A, B y D, teniendo cada uno 7 pares de cromosomas homólogos, habiendo por tanto un total de 42 cromosomas. La meiosis es uno de los procesos más importantes que se llevan a cabo en la célula y es a través del cual, una célula diploide (2n) da lugar a cuatro células haploides (n). Este proceso es la base de la reproducción sexual y da variabilidad genética a las poblaciones, por lo tanto, hace que las especies puedan evolucionar. Este proceso se divide en varias fases Meiosis I, que consta de varias etapas donde se produce el apareamiento y recombinación genética entre los cromosomas homólogos y donde cada célula tendrá dos cromátidas hermanas que, debido a esa recombinación e intercambio de material genético, ya no serán iguales entre sí. Posteriormente vendrá la Meiosis II que sería como una división mitótica donde las cromátidas hermanas se dividen dando lugar a las cuatro células haploides y cada cromosoma contando sólo de una cromátida. Durante la meiosis, las regiones terminales de los cromosomas, telómeros y subtelómeros, formados por repeticiones en tándem, tienen un papel crucial en el reconocimiento y asociación de los cromosomas homólogos. Los telómeros están muy conservados evolutivamente, pero en cambio no ocurre así con los subtelómeros, teniendo estos una gran variabilidad incluso entre distintos brazos del cromosoma. Esto hace pensar, que los subtelómeros pueden tener una función específica dentro de la célula, aunque se sospecha que juegan un papel específico en el reconocimiento durante la meiosis. Esto junto con los pocos estudios que hay sobre esta región terminal del cromosoma, nos hizo querer profundizar un poco más en su papel dentro de la célula y así poder plasmar los resultados obtenidos en esta tesis. Durante la meiosis, el trigo poliploide, se comporta como un diploide y el responsable de que los cromosomas homeólogos o parecidos no apareen es el locus Ph1(Pairing homologous), este está situado en el brazo largo del cromosoma 5B. Este locus ha sido estudiado en profundidad, pero a día de hoy sigue siendo un misterio todas las funciones que tiene durante la meiosis. Es por esto que quisimos profundizar un poco más su papel en la célula, y así poder elucubrar las funciones de este locus. Una de las técnicas que nos ha servido para poder estudiar los objetivos que nos planteamos en esta tesis ha sido la hibridación in situ. Esta técnica nos permite localizar secuencias o cromosomas introgresados dentro de, nuestro caso, el trigo. Esta hibridación nos ha posibilitado poder seguir los cromosomas introgresados de cebada, cultivada (Hordeum vulgare) y silvestre (Hordeum chilense) en el fondo genético del trigo y así estudiar el comportamiento de estos dentro de la célula. 2. Contenido de la investigación Dada la falta de estudios de las regiones terminales, sobre todo de los subtelómeros, para saber su funcionalidad, en el presente trabajo nos planteamos estudiar un poco más el papel de los mismos dentro de la célula. Para ello partimos de dos líneas de adición disómicas del cromosoma 3Hch en el fondo genético de trigo harinero, una con una delección terminal en el brazo corto al que le faltaba la región subtelomérica y otra con una delección terminal en el brazo largo que si mantenía la región subtelomérica. El comportamiento de estas líneas fue estudiado durante la meiosis temprana, paquiteno y metafase I, y gracias a la hibridación in situ se pudo seguir el rastro de estos cromosomas dentro del fondo de trigo. Se observó que las líneas sin región subtelomérica, delección del brazo corto, no apareaban por el brazo sin esta región terminal, apareciendo estas como univalentes y por el contrario las líneas con ambas regiones subteloméricas presentes en ambos brazos, apareaban en su totalidad y aparecían como bivalentes en la metafase I. La inmunolocalización con proteínas del complejo sinaptonémico durante la fase de paquiteno en estas líneas confirmó que la formación del mismo dependía de la presencia de la región subtelomérica. Adicionalmente, se realizó un estudio de líneas de adición monosómicas de H. vulgare (cebada cultivada) y H. chilense (cebada silvestre) para el mismo grupo de homología y distinto en el fondo genético de trigo harinero durante la meiosis para ver el comportamiento de estos cromosomas introgresados en el fondo genético con el locus Ph1 presente. La técnica de hibridación in situ nos permitió estudiar y seguir el comportamiento de estos cromosomas de Hordeum durante el estadio de paquiteno en la meiosis y observar que los cromosomas homeólogos del mismo grupo de homeología se asociaban y apareaban, pero en cambio no se observó ninguna recombinación o introgresión en las fases tardías de la meiosis. Para los cromosomas homeólogos de distinto grupo de homeología, no se observó ni apareamiento, ni asociación en ninguna etapa de la meiosis. Además, se realizó un estudio comparativo entre líneas de adición monosómicas de ambas cebadas, cultivada y silvestre, para el mismo y distinto grupo de homeología en el fondo genético de trigo harinero mutante ph1b, es decir con ausencia del locus Ph1. Estas líneas se desarrollaron para el experimento y así se pudo estudiar durante la meiosis el comportamiento de estos cromosomas introgresados y ver el efecto de la falta del locus Ph1. La aplicación de la técnica in situ, permitió observar que los cromosomas introgresados de Hordeum, de ambas líneas, se asociaban y apareaban, aunque en distinta proporción, en paquiteno y que, además esta asociación continuaba a lo largo de toda la meiosis, produciéndose distintas asociaciones entre trigo y cebadas o entre ambas. 3. Conclusión La ausencia de la región subtelomérica en los cromosomas de Hordeum chilense y el estudio de estos cromosomas en meiosis en los que no se veía asociación durante el paquiteno, sugiere que esta región terminal del cromosoma es importante para que tenga lugar este reconocimiento, apareamiento y asociación en las primeras fases de la meiosis. El estudio de la meiosis de las líneas monosómicas de adición de H. vulgare y H. chilense en el fondo genético de trigo harinero, y viendo los resultados obtenidos, sugirió, por tanto, que el locus Ph1 no impide la asociación de cromosomas homeólogos, pero sí en cambio que se produzca recombinación entre ellos. En líneas de adición monosómicas de H. vulgare y H. chilense en fondo genético de trigo con ausencia del locus Ph1, se observó que se producía asociación a lo largo de toda la meiosis, por lo que se sugiere que este locus es importante a la hora de obstaculizar esta asociación. 4. bibliografía Bass H.W., Riera-Lizarazu O., Ananiev E.V., Bordoli S.J., Rines H.W., Phillips R.L., Sedat J.W., Agard D.A., Cande W.Z. (2000) Evidence for the coincident initiation of homolog pairing and synapsis during the telomere-clustering (bouquet) stage of meiotic prophase. Journal of Cell Science 113:1033-1042. Cabrera A., Martin A., Barro F. (2002) In situ comparative mapping (ISCM) of Glu-1 loci in Triticum and Hordeum. Chromosome Research 10:49-54. Hudakova, S.,Michalek, W., Presting, G. G., ten Hoopen, R., dos Santos, K., Jasencakova, Z., Schubert, I.(2001) Sequence organization of barley centromeres. Nucleic Acids Research 29:5029-35. Jasencakova, Z, Meister, A., Schubert, I. 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