Inmovilización y estabilización de una enzima nucleósido 2 -desoxirribosil transferasa para la optimización de procesos de producción de compuestos de interés farmacéutico

Resumen

Los nucleósidos no naturales son análogos, estructuralmente similares a los nucleósidos que componen los ácidos nucleicos de los seres vivos, que se han utilizado desde hace décadas para fines biomédicos. Las diferencias con los nucleósidos naturales, aun siendo pequeñas, suelen conllevar alteraciones importantes en su comportamiento in vivo. La manera tradicional de síntesis de nucleósidos no naturales era por métodos químicos, en los que eran necesarias reacciones complejas con varios pasos, uso de gran número de reactivos (con la consiguiente generación de residuos) y condiciones drásticas de pH y temperatura. A día de hoy, con la necesidad de una transición hacía la Química Verde, reacciones como las requeridas para la síntesis nucléosidos no naturales deberían sustituirse por procesos más sostenibles y limpios. En esta Tesis se realizaron estudios integrados de ingeniería de catalizadores enzimáticos, diseño de reacciones en sistemas bifásicos acuosos y posterior simplificación de dichos sistemas bifásicos para su aplicación en reactores de flujo continuo. Como fin último, se enfocaron estos estudios en la síntesis del nucleósido no natural 2-cloro-2’-desoxiadenosina o cladribina (CdA), un compuesto de interés farmacológico, actualmente utilizado como terapia frente a patologías como leucemia, linfoma o esclerosis múltiple. La enzima nucleósido 2’-desoxirribosil transferasa de Trypanosoma brucei (TbNDT) está descrita que es capaz de realizar la reacción de síntesis de CdA, presentándose como una herramienta útil para nuestro objetivo. Por esta razón, se inmovilizó y estabilizó por unión covalente multipuntual a soportes glioxil-agarosa y se mejoró por posterior recubrimiento con polímeros hidrofílicos, logrando una herramienta robusta, con las propiedades óptimas. A su vez, fue necesario abordar la ingeniería de la reacción para solventar inconvenientes importantes, como la dificultad de manejo de la base aceptora de interés (2-cloroadenina, ClA) o la existencia de una reacción secundaria indeseable de hidrólisis, realizada también por NDT, que fue necesario minimizar. El derivado inmovilizado y modificado con polímeros fue la base para crear un sistema bifásico simplificado, en el que la fase polar se encuentra anclada al soporte de inmovilización junto a la enzima (p.ej., rodeándola por completo con polietilenimina) y utilizando disolventes no viscosos (etanol o dimetilformamida, DMF) en el medio de reacción como fase apolar, logrando la extracción de producto al disolvente e inhibiendo su hidrólisis. La síntesis del producto de interés cladribina se tuvo que realizar en medios alcalinos con concentración alta de DMF para poder solubilizar concentraciones aceptables del sustrato ClA; gracias al sistema bifásico optimizado y a la alta estabilidad del biocatalizador de TbNDT en condiciones exigentes, pudo llevarse a cabo. Finalmente arrojó productividades interesantes (1 g/l), mantenidas durante 3 días, en reacciones en flujo continuo con reactores de lecho fijo