Effect of arginine and glutamine supplementation, dietary soluble fibre level and n-6/n-3 fatty acid ratio on performance and intestinal health

Resumen

El objetivo de esta tesis doctoral ha sido estudiar la capacidad que tienen varios nutrientes de mejorar la salud intestinal de los gazapos. Para lograr este objetivo general, se llevaron a cabo tres objetivos principales. El primer objetivo consistió en describir la evolución con la edad de la microbiota intestinal, el sistema inmune y la morfología de la mucosa tras el destete. Para ello se destetaron 100 gazapos de 20 camadas a los 26 d de edad con un peso de 429 ± 57 g y se sacrificó 1 animal por camada a los 26, 31, 38, 45 y 52 d de edad. Se tomaron muestras de la mucosa intestinal y del apéndice para determinar la morfología de la mucosa y la expresión genética de las citoquinas/interleucinas TNF-α, IFN-ɣ, IL-2, IL-6, IL8, IL-10 e iNOS (en íleon y apéndice). El perfil de la microbiota se estudió en el íleon y en una mezcla de ciego y cecotrofos. El peso relativo del ciego aumentó (P<0,05) desde los 26 hasta los 38 d, y tendió a disminuir y estabilizarse a los 45 y 52 días de edad. La longitud de las vellosidades intestinales y el número de células caliciformes en el yeyuno se redujeron a los 31 d en comparación con los gazapos recién destetados a los 26 d de edad. (P < 0,05), mientras que no se observó ningún efecto en la profundidad de las criptas. A 38 d, no se observaron cambios en las vellosidades, que mostraron valores similares a las determinadas en el destete, mientras que las criptas siguieron aumentando ligeramente (9%). Entre los 38 y los 52 d de edad, la profundidad de las criptas y el número de las células caliciformes se incrementaron (P < 0,05) sin producirse cambios en la longitud de las vellosidades. La evolución del íleon siguió un efecto cuadrático en la proporción de Firmicutes (valor máximo entre los 38 días de edad; P = 0,002), y Bacteroidetes (valor mínimo entre los 38 y los 45 días de edad, P = 0,003). Al destete, Firmicutes y Bacteroidetes representaron cada uno casi la mitad de las unidades taxonómicas operacionales (OTUs) detectadas en el ciego. A medida que aumenta la edad, Bacteriodetes (P< 0,001) es sustituido por Firmicutes (P< 0,001) que a los 52 d representa un 85% de la flora mayoritaria. La expresión relativa del TNF-α en el apéndice aumentó a los 26 y a los 31 d de edad (P < 0,005). Por el contrario, tanto el IFN- ɣ en el apéndice y en el íleon, así como la IL-2 en el íleon incrementaron linealmente con la edad (P ≤ 0,01). En conclusión, tras el destete se produce un balance específico entre Firmicutes y Bacteroidetes en el íleon y en el ciego produciéndose cambios temporales en la morfología de la mucosa y en la respuesta inmune como parte del proceso de maduración del gazapo. Todo ello da lugar a un periodo de susceptibilidad a patógenos pero también para poder utilizar diferentes estrategias nutricionales que modulen el sistema inmune y la microbiota intestinal. El segundo objetivo fue determinar el efecto de la suplementación de la dieta con arginina y glutamina sobre la productividad de las conejas reproductoras y los gazapos así como sobre la salud intestinal de los gazapos. Para alcanzar este objetivo se llevaron a cabo tres pruebas diferentes. Todas las pruebas realizadas se desarrollaron utilizando las mismas dietas experimentales. Así se formuló una dieta control (C) que contenía 29,8 g de nitrógeno (N), 313 g de aFNDom por kg MS y 1,85 g de N digestible/ MJ de energía digestible (ND/ED) y se fabricaron otros 3 piensos añadiendo (en g/kg) 4 de arginina (Arg), 4 de glutamina (Gln) y una mezcla de un 4 de arginina y un 4 de glutamina (Arg + Gln) a la dieta control. En el primer estudio se determinó si la suplementación de la dieta con arginina, glutamina o con una combinación de ambos influía sobre la digestibilidad, la composición corporal y los rendimientos productivos de las conejas reproductoras y sus camadas durante las tres primeras inseminaciones. Para ello se utilizaron 80 conejas nulíparas asignadas al azar a los piensos experimentales (20/tratamiento) antes de la primera inseminación. Tras cada parto se llevó a cabo la homogenización de las camadas dentro de cada tratamiento y las conejas fueron inseminadas 11 días después. A lo largo de los tres primeros partos se midieron la composición química y el contenido en energía de las conejas (mediante impedancia bioeléctrica), sus rendimientos productivos, el crecimiento de las camadas y la producción de leche entre el nacimiento y el destete (25 d). La suplementación con amino ácidos incrementó el contenido en ND (P = 0,015) y tendió a incrementar el ratio ND/ED en comparación con el grupo C (P = 0,077) dando lugar a un incremento de la ingestión del ND durante la lactación (P = 0,004). En este periodo, el grupo Gln presentó una ingestión mayor de ED en comparación con los grupos C y Arg+Gln (P = 0,038). El número total de gazapos nacidos por camada tendió a incrementarse en las conejas suplementadas con Arg y Gln, comparadas con los grupos C y Arg+Gln (P = 0,095), aunque no hubo efecto de los tratamientos sobre el número de gazapos destetados (P = 0,15). La suplementación individual con Arg y Gln incrementó el peso de las camadas a 20 y 25 d respecto a los grupos C y Arg+Gln (P ≤ 0,021). La suplementación con los amino ácidos no afectó a la producción de la leche (P = 0,16), aunque hubo una correlación positiva entre la ingestión de ED y ND (P < 0,001). No hubo efectos significativos de los tratamientos sobre el peso, la composición química y el contenido en energía de las conejas, aunque las conejas suplementadas con Arg o con Gln tendieron a tener un mayor contenido en energía en el momento de la tercera inseminación y al destete que aquellas de los grupos C y Arg+Gln (P ≤ 0,099). La suplementación con amino ácidos no modificó la tasa de reposición de las conejas. En conclusión, la suplementación individual con Arg y Gln tuvo efectos positivos en el peso y el tamaño de la camada al nacimiento, pero no hubo efectos aditivos cuando se suplementó con la combinación de Arg+Gln. En la segunda prueba se midió el crecimiento, la digestibilidad ileal y fecal así como la eficiencia del nitrógeno y la energía de los gazapos suplementados con arginina y glutamina desde la gestación y la lactación, a través de la suplementación de sus madres con las mismas dietas, y tras el destete recibiendo los mismos piensos suplementados con los amino ácidos. Los gazapos fueron destetados a los 25 d de edad y los rendimientos productivos se midieron hasta los 55 d de edad. En el ensayo T1a los gazapos se alimentaron con los mismos piensos que recibieron sus madres durante todo el periodo experimental, mientras que en los ensayos T1b, T2 y T3 se alimentaron con las dietas experimentales desde los 25 hasta los 35 d de edad, y después con el pienso C hasta los 55 d de edad. Para el ensayo de digestibilidad se utilizaron 96 gazapos que fueron bloqueados por camada y asignados al azar entre los tratamientos. La composición de la canal y la eficiencia de utilización del nitrógeno y de la energía se midieron en 104 animales pertenecientes al ensayo T1a. Cuando los animales fueron suplementados con los piensos experimentales durante todo el cebo, la mortalidad fue similar para todos los tratamientos (P = 0,92), sin embargo, los gazapos alimentados con glutamina durante el primer periodo (25-35 d de edad), tendieron a disminuir su mortalidad en el periodo global de cebo (P = 0,10) en comparación con los gazapos no suplementados. Los tratamientos no afectaron a los rendimientos productivos de los gazapos independientemente del ensayo realizado (P > 0,05). La digestibilidad ileal de la mayoría de los aminoácidos mejoró con la suplementación con los amino ácidos (P ≤ 0,10). La digestibilidad fecal de la materia seca y del nitrógeno aumentaron (P < 0,05) en los animales alimentados con los piensos Arg, Gln o Arg+Gln mientras que la digestibilidad fecal de la energía se incrementó en los gazapos suplementados con arginina o con glutamina (P = 0,003). La digestibilidad fecal de la FND fue mayor con los piensos Gln y Arg+Gln (P <0,001). La suplementación con arginina disminuyó la eficiencia del nitrógeno y de la energía (P < 0,001) debido a que aumentó el consumo tanto de nitrógeno como de energía digestible (P < 0,001) mientras que la retención de nitrógeno y energía en la canal fue similar independientemente de la suplementación. Además con la suplementación con arginina, las pérdidas de nitrógeno en la piel y las vísceras tendieron a aumentar (P = 0,098) y aumentaron las pérdidas en orina (P = 0,030) así como las pérdidas de energía en forma de orina + producción de calor (P = 0,003). En la tercera prueba se estudió si la exposición a la glutamina, la arginina o a la combinación de ambas desde la gestación y la lactación a través de la suplementación de sus madres con las mismas dietas, y tras el destete recibiendo los piensos suplementados con los amino ácidos, estimulaban el crecimiento, el desarrollo del tracto digestivo y la respuesta inmune. Los gazapos fueron destetados a los 25 d de edad y alimentados con las mismas dietas experimentales que sus madres durante 10 días, hasta los 35 d de edad. Se determinó la translocación bacteriana a los nódulos linfáticos mesentéricos (NLM) a los 6 días de edad y la morfología intestinal de la mucosa, su actividad enzimática y el análisis fenotípico y funcional de los linfocitos intraepiteliales (LIE) del apéndice a los 6, 25 y 35 días de edad. No hubo diferencias significativas en los rendimientos productivos y la mortalidad entre los tratamientos, Sin embargo, los gazapos procedentes de camadas suplementadas con Gln tendieron (P ≤ 0,10) a reducir tanto el número de bacterias aeróbicas como facultativas translocadas hacia los NLM. Sin embargo, la suplementación con Gln limitó la longitud de las vellosidades intestinales al destete en comparación con las dietas no suplementadas (P < 0,05). Las proporciones de linfocitos intraepiteliales CD45+CD4+ y CD45+CD8+ en el apéndice no se vieron afectadas por los tratamientos. Sin embargo, la suplementación con Gln al destete aumentó la expresión de la IL-2 y la IL-10, disminuyendo la expresión de la IL-6 de los linfocitos intraepiteliales en el momento del destete. En conclusión, a pesar de no haber un efecto sobre los rendimientos productivos y la mortalidad, la inclusión de 0,4 % de Gln tuvo un efecto positivo manteniendo la longitud de las vellosidades intestinales e induciendo un perfil de citoquinas más moderado y una respuesta Th1-Th2 más equilibrada al destete. La suplementación con Arg o con Arg+Gln a las dosis seleccionadas en este estudio no rindieron ningún efecto beneficioso en las variables estudiadas. El tercer objetivo de la tesis fue determinar el efecto de la inclusión de dos niveles de fibra soluble y dos relaciones de ácidos grasos n-6/n-3 sobre la productividad de las conejas reproductoras y los gazapos así como sobre la salud intestinal de los gazapos en crecimiento. Para alcanzar este objetivo se llevaron a cabo tres pruebas diferentes. Todas las pruebas realizadas se desarrollaron utilizando las mismas dietas experimentales. Se formularon cuatro piensos (BFS_Bn-6/n-3, BFS_An-6/n-3, AFS_Bn-6/n-3 y AFS_An-6/n-3) con dos niveles de fibra soluble (BF: 7,8 vs. AF: 14,4% MS) y dos ratios n-6/n-3 (Bn-6/n-3: 13,4 vs. An-6/n-3: 3,5). En el primer estudio se determinó si la inclusión de dos niveles de fibra soluble y dos relaciones de ácidos grasos n-6/n-3 influía sobre la digestibilidad, la composición corporal y los rendimientos productivos de las conejas reproductoras y sus camadas durante las cuatro primeras lactaciones. Para ello se utilizaron 96 conejas nulíparas asignadas al azar a los piensos experimentales (24/tratamiento) antes de la primera inseminación. Tras cada parto se llevó a cabo la homogenización de las camadas dentro de cada tratamiento y las conejas fueron inseminadas 11 días después. A lo largo de los cuatro primeros partos se midieron la composición química (mediante impedancia bioeléctrica) y el contenido en energía de las conejas, sus rendimientos productivos, el crecimiento de las camadas y la producción de leche entre el nacimiento y el destete (25 d). La proporción total de conejas eliminadas disminuyó con la AFS respecto al grupo de BFS (22,9 vs. 50,0%; P = 0,005), tendiendo a disminuir en el grupo BFS cuando se incrementaba el ratio de n-6/n-3 y en el grupo de AFS cuando se disminuía el ratio n-6/n-3 (P = 0,059). El incremento del nivel de fibra soluble redujo el ratio PB/ED (4%; P < 0,001) e incrementó la digestibilidad de todas las fracciones de la fibra (P < 0,001). La reducción del ratio n-6/n-3 redujo la digestibilidad de la fibra dietética total en las conejas que recibieron BFS sin tener efecto en aquellas alimentadas con las dietas AFS (P = 0,043). Los tratamientos no afectaron a la ingestión entre partos (P = 0,16), aunque la ingestión de PB digestible entre partos fue menor en el grupo AFS en comparación con el grupo BFS (P = 0,003). No se observó ningún efecto relevante de los tratamientos sobre el número de gazapos nacidos totales, el peso medio de los gazapos al nacimiento o en el tamaño de la camada al destete, la fertilidad, la eficiencia alimenticia de las conejas, la producción de leche y la composición química y el contenido en energía de las conejas (P ≥ 0,29). El peso medio de los gazapos al destete perteneciente a madres alimentadas con BFS_An-6/n-3 y AFS_Bn-6/n-3 disminuyó en un 6% en comparación con aquellas de los otros dos grupos (P = 0,030). La reducción del ratio n-6/n-3 en la dieta incrementó el contenido en grasa de la leche en un 12% sin afectar al contenido de proteína ni de MS (P = 0,031). La proporción de ácidos grasos impares y de ácidos grasos saturados se incrementó en las conejas alimentadas con AFS en comparación con aquellas alimentadas con dietas con BFS (P ≤ 0,037) sin observarse efecto del ratio n-6/n-3 (P ≥ 0,37). La reducción del ratio n-6/n-3 redujo la concentración de C18:1n-9 en la leche (en un 19%; P < 0,001) e incrementó la proporción de C18:3n-3 (en un 306%; P < 0,001). En conclusión, la fibra soluble redujo la tasa de reposición de las conejas sin verse afectado por el ratio n-6/n-3, mientras que ambos factores modificaron la composición de la leche y su perfil de ácidos grasos sin influir en la productividad de las camadas. En la segunda prueba se estudió si la inclusión de dos niveles de fibra soluble y dos relaciones de ácidos grasos n-6/n-3 o la combinación de ambos influía sobre los rendimientos productivos, la composición corporal y la eficiencia de retención del nitrógeno y la energía en gazapos en cebo. Se utilizaron 40 gazapos/pienso destetados a 26 d de edad para determinar la composición corporal y de la canal mediante impedancia bioeléctrica a los 27, 39, 62 y 69 d de edad. El incremento de fibra soluble redujo la mortalidad en el periodo global experimental (38,3 vs. 24,1%; P = 0,018), sin observarse ningún efecto del ratio n-6/n-3. La eficiencia alimenticia en el periodo global (26-62 d de edad) mejoró con el incremento de fibra soluble (en un 3,5%; P = 0,003) y con la reducción del ratio n-6/n-3 (en un 2,3%; P ≤ 0,048). El incremento de fibra soluble disminuyó el ratio de PB/ED (en un 2,3%; P = 0,050). Los gazapos alimentados con las dietas con Bn-6/n-3 tendieron a presentar menor contenido en grasa corporal y mayor proporción de proteína al destete (26 d de edad), aunque al final del cebo (62 d de edad) tendieron a ser más pesados y a tener mayor contenido de grasa corporal y menor proporción de proteína (P ≤ 0,11). El incremento de fibra soluble y la reducción del ratio n-6/n-3 redujeron el nitrógeno digestible ingerido (en un 4%; P ≤ 0,030). Sin embargo, la cantidad de nitrógeno retenido en el cuerpo o en la canal no se vieron afectados por los tratamientos (P ≥ 0,26). En consecuencia, el incremento de fibra soluble mejoró la eficiencia de retención del nitrógeno digestible tanto en el cuerpo como en la canal (en un 5,4 y 4,7%, respectivamente; P ≤ 0,034). Además, la reducción del ratio n-6/n-3 incrementó la eficiencia de retención del nitrógeno digestible tanto en el cuerpo como en la canal (3,9 and 3,4%, respectivamente; P ≤ 0,043). Esta mejora de la eficiencia del nitrógeno estuvo asociada con una reducción de la excreción del nitrógeno en la orina en el grupo AFS respecto al grupo BFS (en un 13%; P = 0,004) y en el grupo Bn-6/n-3 respecto al An-6/n-3 (P = 0,072). Los tratamientos no afectaron a la ingestión de la ED y a la retención de energía del cuerpo y la canal (P ≥ 0,13). El incremento de fibra soluble mejoró la eficiencia de retención de la energía digestible en el cuerpo y en la canal (en un 2,7 y 3,0%; P ≤ 0,042). La mejora en la retención de la energía digestible en la canal en el grupo de AFS se debió principalmente al deterioro observado en los gazapos alimentados con BFS_An-6/n-3 respecto a aquellos alimentados con la dieta BFS_Bn-6/n-3 (P = 0,071). No hubo ninguna influencia de la fibra soluble sobre las pérdidas de energía en forma de orina y producción de calor, aunque tendieron a ser menores cuando disminuyó el ratio n-6/n-3 (P = 0,058). Las pérdidas de energía en las heces fueron menores con AFS que con BFS (en un 6,1%; P < 0,001). En conclusión, el incremento de fibra soluble incrementó la supervivencia de los gazapos en cebo, sin ninguna influencia del ratio n-6/n-3. Por el contrario, tanto el incremento de la fibra soluble como la reducción del ratio n-6/n-3 mejoraron la eficiencia de la energía digestible y la proteína retenida en el cuerpo y en la canal. No se encontraron efectos aditivos de ambos factores. En la tercera prueba se estudió si la inclusión de dos niveles de fibra soluble y dos relaciones de ácidos grasos n-6/n-3 o la combinación de ambos influía sobre la digestión y la respuesta inmune de los gazapos tras el destete. Los gazapos utilizados provenían de conejas alimentadas con los mismos piensos descritos, y todos los gazapos recibieron los mismos piensos que habían consumido sus madres. Para determinar la mortalidad tras el destete se realizaron tres pruebas diferentes. En la primera, 517 gazapos se alojaron de forma colectiva y se alimentaron con los piensos experimentales desde los 26 hasta los 39 d de edad, y con un pienso comercial desde los 39 hasta los 54 d de edad. En la segunda prueba, se utilizaron 853 gazapos destetados a 26 d de edad, alojados en colectivo y alimentados con el pienso comercial tras el destete (26 d de edad). En la tercera prueba, se midió la digestibilidad fecal de los nutrientes y se registró la mortalidad utilizando 56 gazapos (14/tratamiento). En una cuarta prueba, se utilizaron otros 208 gazapos que fueron destetados a los 26 días de edad y sacrificados a los 39 d para recoger la digesta ileal y determinar así la digestibilidad ileal de los nutrientes, los pesos de los órganos digestivos, el pH cecal y la mucosa tanto del apéndice como del íleon para determinar la respuesta inmune. El incremento de FS redujo la mortalidad entre los 26 y los 39 d de edad, o hasta el final del cebo cuando el pienso comercial solo se admistraba entre los 39 y los 54 d de edad, mientras que no hubo diferencias cuando se administró una dieta común desde el destete hasta el final del cebo. El incremento del ratio n-6/n-3 mejoró la digestibilidad fecal de la FDT y la fibra soluble únicamente de los gazapos alimentados con un nivel bajo de FS (P < 0,05). Los gazapos alimentados con altos niveles de FS tendieron a tener mayor digestibilidad ileal del almidón y mayor flujo de mucinas en comparación con aquellos gazapos alimentados con bajos niveles de FS (P ≤ 0,064). El nivel de FS y el ratio n-6/n-3 tuvieron una menor influencia en la expresión de los genes relacionados con la inmunidad en el apéndice. Así, en el apéndice, la IL 8 mostró una menor expresión en los gazapos alimentados con los piensos Ln-6/n-3 y BFS (P = 0,04) sin tener efecto en aquellos animales alimentados con AFS. La expresión de la IL-6 tendió (P = 0,09) a mostrar un comportamiento similar. También, la expresión del TLR-4 disminuyó (P = 0,03) en los gazapos alimentados con los piensos Bn-6/n-3. Los gazapos alimentados con piensos altos en FS mostraron una mayor expresión del gen MUC-13 (P = 0,046) y una menor expresión ileal de iNOS (P = 0,050) que aquellos que recibieron las dietas bajas en FS. Por el contrario, la reducción del ratio n-6/n-3 incrementó la expresión ileal de IL-2, IL-10 IFN- ɣ y TLR-2 (P ≤ 0,028).