Inmovilización y co-inmovilización de lipasas utilizando soportes hidrofóbicosNuevas estrategias para reusar las enzimas más estables en los combi-biocatalizadores

Resumen

La utilización industrial de biocatalizadores de lipasas se ve facilitada por su inmovilización, la cual permite su recuperación y puede mejorar otras propiedades enzimáticas. El peculiar mecanismo de acción catalítica que poseen las lipasas, denominado activación interfacial, les permite adsorberse en superficies hidrofóbicas a baja fuerza iónica, tales como aquellas que muestran los soportes hidrofóbicos. Estos soportes permiten la inmovilización reversible, purificación, hiperactivación y estabilización de las lipasas en un solo paso, fijando la forma monomérica y abierta de las lipasas. En la presente tesis doctoral se ha explotado el potencial de estos soportes en la inmovilización y co-inmovilización de las lipasas. En primer lugar, el uso de este método de inmovilización ha permitido comparar adecuadamente las propiedades (actividad, especificidad, estabilidad) de diferentes lipasas. Así, la estabilidad de las lipasas inmovilizadas por activación interfacial en el soporte hidrofóbico octil agarosa posee una dependencia específica con respecto al medio de reacción, siendo la presencia de aniones fosfato a pH 7,0 muy negativa, pero no tanto cuando se inmovilizan por otros métodos. Además, se ha demostrado que las condiciones de inmovilización estudiadas determinan significativamente las propiedades de algunas lipasas inmovilizadas en este soporte (la lipasa de Rhizomucor miehei (RML), la lipasa de Pseudomonas fluorescens (PFL) y la lipasa de Thermomyces lanuginosus (TLL)), mientras que apenas afectan a las propiedades del biocatalizador en el caso de la lipasa B de Candida antarctica (CALB) y la lipasa de Candida rugosa (CRL). Esto puede limitar la reproducibilidad de los biocatalizadores, pero, si se controla adecuadamente, puede utilizarse para producir una biblioteca de biocatalizadores inmovilizados de la misma lipasa usando el mismo soporte, con diferentes propiedades, únicamente cambiando las condiciones de inmovilización. Por otro lado, la estrategia de inmovilización de lipasas en multicapas utilizando polietilenimina (PEI) como agente conector entre las capas de lipasas y glutaraldehído como agente entrecruzante, ha aumentado la capacidad de carga de soportes porosos. Asimismo, el uso de esta estrategia ha permitido co-inmovilizar cinco lipasas diferentes, controlando la distribución espacial de las mismas simplemente controlando el orden de inmovilización. Sin embargo, los problemas de difusión y el aumento en la tortuosidad del camino que debe seguir el sustrato hasta las capas inferiores de enzima pueden provocar una disminución en la actividad de las enzimas inmovilizadas al añadir una nueva capa de enzima. Por último, se han diseñado dos estrategias que solucionan el problema de co-inmovilizar lipasas con estabilidades muy diferentes. En la primera estrategia, se usan soportes heterofuncionales octil-glioxil agarosa, y una inmovilización enzima a enzima. La enzima más estable (CALB) es inmovilizada primero por activación interfacial y después unida covalentemente. Tras reducir el soporte, las enzimas menos estables (LEU y RML) son inmovilizadas sobre la superficie libre únicamente vía activación interfacial, de forma que pueden ser liberadas al medio tras su inactivación, al incubarse con detergentes. Esta estrategia ha permitido reutilizar CALB inmovilizada, manteniendo su actividad y estabilidad, durante varios ciclos de inactivación, desorción con detergente y recarga de las enzimas menos estables. La segunda estrategia, consiste en inmovilizar las lipasas más estables (la lipasa A de Candida antárctica (CALA), CALB y TLL) sobre soportes hidrofóbicos vía activación interfacial, recubrirlas con PEI, e inmovilizar sobre esta capa de polímero las lipasas menos estables (LEU y RML) mediante intercambio iónico. Tras la inactivación de las enzimas menos estables inmovilizadas reversiblemente, estas pueden liberarse al medio por incubación a elevada fuerza iónica. Esta estrategia ha permitido reutilizar CALA, CALB y TLL inmovilizadas primero por activación interfacial y después por unión covalente en octil-vinilsulfona agarosa, sin afectar a su actividad o estabilidad, durante cinco ciclos de inactivación, desorción con alta fuerza iónica de LEU y RML, recubrimiento con PEI y recarga de las enzimas menos estables.