Caracterización genómica, proteómica y de la virulencia de aislamientos clínicos de Cryptococcus neoformans var. Grubiiefecto del hierro y el cobre

Resumen

El éxito de un microorganismo en el establecimiento de una infección se centra en la capacidad de competir y adquirir micronutrientes a expensas del hospedero. Cryptococcus neoformans es el agente causante de la criptococosis, enfermedad asociada principalmente a la inmunosupresión del VIH y caracterizada por causar meningitis. El objetivo de este trabajo fue caracterizar el genotipo, la virulencia, el proteoma y el efecto del hierro y del cobre sobre la modulación de la patogenicidad en aislamientos clínicos colombianos de Cryptococcus neoformans var. grubii. Se genotiparon 29 aislamientos utilizando el esquema de MLST, identificándose 11 secuencias tipo (ST), siendo la ST69 la más frecuente seguida de ST2, ST93 y ST377. A continuación, se evaluó la patogenicidad de los aislamientos en G. mellonella clasificándolas en patogenicidad alta (12), intermedia (10) y baja (7) y se analizaron los principales factores de virulencia, cápsula y melanina. En general, en los aislamientos con baja patogenicidad se observaron cápsulas de mayor tamaño (1.730 µm de promedio) respecto a los de patogenicidad alta (0.630 µm) o (0.498 µm). Además, mediante un análisis de componentes principales, se encontró relación entre el incremento del tamaño capsular, tras su inducción in vitro o in vivo, y los aislamientos de alta patogenicidad. Con respecto a la melanina, tanto entre los aislamientos de alta, como de intermedia y baja patogenicidad se detectaron cepas con todos los niveles de pigmentación. Tras la secuenciación del genoma completo de los 29 aislamientos y el análisis de polimorfismos (SNPs), se determinaron 48 variantes no sinónimas asociadas con genes asociados a cápsula, melanina y patogenicidad, como PTP1, PMT4, IPK1, PBX2, OVA1 y ROM2, y ubicadas en los dominios funcionales predichos para 39 genes. Además, en 9 de estos genes los cambios detectados implicaban la aparición de codones de parada. Posteriormente, se exploró el efecto de hierro y cobre en el crecimiento, patogenicidad y principales factores de virulencia de aislamientos clínicos de C. neoformans var. grubii. La levadura fue capaz de crecer a concentraciones de hasta 50 ¿M de hierro y 500 ¿M de cobre. A continuación, se comparó la patogenicidad tras el precultivo con hierro y cobre y sin precultivo con los metales de 10 aislamientos con diferentes perfiles de patogenicidad basal. En el 90% de los aislamientos aumentó la patogenicidad con la combinación de 50+500 µM de hierro y cobre respectivamente. Igualmente, se observó un aumento del crecimiento de la cápsula, se aceleró la producción de melanina y se indujo la aparición de células tipo titán. Para obtener información de los mecanismos implicados en los rasgos de virulencia inducidos en la combinación con 50 ¿M hierro y 500 ¿M de cobre, se realizó un análisis proteómico comparativo de extractos citoplasmático de dos aislamientos clínicos (H0058-I- 2807 y H0058-I-3102) con diferente grado de patogenicidad tras su crecimiento con y sin metales. Se detectaron 49 proteínas que variaron su abundancia y eran comunes entre los dos aislamientos: 30 con mayor abundancia, 14 con menor y 5 con diferente cambio según el aislamiento. Aumentó la abundancia de proteínas relacionadas con procesos de estrés celular, tráfico vesicular (Ap-1, Vps35), estructura de la pared celular (Och1, Ccr4, Gsk3), biosíntesis de pigmento (Hem15, Mln2), reparación de ADN (Chk1), transporte de proteínas (Mms2), así como proteínas asociadas a la SUMOilación (Uba2) y un transportador mitocondrial (Atm1). Por lo tanto, la presencia del precultivo con los metales influye sobre la abundancia de proteínas involucradas en la patogenicidad. En conclusión, el conjunto de los resultados obtenidos en este trabajo proporciona información de gran relevancia para el conocimiento de la patogénesis de C. neoformans y descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas frente a esta levadura.