Genetic and phenotypic characterization of Toxoplasma gondii isolates obtained from sheep and Iberian pigs in Spain

Resumo

Toxoplasma gondii es un parásito apicomplejo de distribución mundial con un ciclo biológico heteroxeno facultativo que prácticamente incluye a todos los animales homeotermos, incluidos los seres humanos, como hospedadores intermediarios, y a los felinos como únicos hospedadores definitivos. El carácter de agente abortigénico, y la naturaleza zoonósica y de transmisión alimentaria de la infección por T. gondii hacen que la toxoplasmosis sea una preocupación importante para la salud pública y animal en todo el mundo. Sin embargo, la información disponible sobre los genotipos circulantes en Europa, y por extensión en España, es muy limitada, y el conocimiento sobre sus características fenotípicas es prácticamente nulo. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral fue obtener un panel representativo de aislados de T. gondii procedentes de especies ganaderas españolas, concretamente ganado ovino y cerdo ibérico, que permitiera estudiar la diversidad genética y fenotípica de la población de T. gondii circulante en dichas especies mediante la implementación de metodologías moleculares y modelos in vivo e in vitro. Durante la investigación, se obtuvo un panel de 35 aislados circulantes en ovejas y cerdos ibéricos que abarca una amplia superficie del país, y especialmente, las regiones líderes en la cría de ganado ovino y porcino ibérico. Los resultados de la caracterización genética de los aislados mediante el método PCR-RFLP basado en 11 marcadores fueron similares a los datos europeos disponibles sobre genotipado de cepas de T. gondii que infectan animales domésticos, y destacan el predominio específico de la variante PRU del genotipo II clonal dentro del haplogrupo 2 y la notable prevalencia de las cepas de tipo III clonal. En cuanto a la caracterización fenotípica de los aislados, se diseñó un protocolo de evaluación de su virulencia en ratón, incluyendo parámetros letales y no letales, que en el caso de los aislados de origen ovino se combinó con el estudio de la invasión y proliferación in vitro en una línea celular de trofoblasto ovino (AH-1). En general, los aislados de tipo II poseían características no virulentas, y los aislados de tipo III presentaron el perfil más virulento entre las cepas evaluadas, aunque cabe destacar la gran variabilidad fenotípica intra-genotipo dentro de ambos tipos genéticos en la población española de T. gondii. Estos hallazgos están en contradicción con las clasificaciones convencionales que consideraban a las cepas de tipo III como las menos virulentas entre los tres tipos clonales de T. gondii, demostrando que los métodos de caracterización genética ampliamente utilizados en la actualidad no son suficientemente resolutivos para clasificar la virulencia de la población de Toxoplasma. La combinación alélica de los loci CS3/ROP18/ROP5 de los aislados seleccionados no estuvo asociada con el grado de virulencia observado, proporcionando nuevas evidencias de que otros factores genéticos deben estar involucrados en la virulencia de T. gondii en ratón. En este estudio, se han puesto en evidencia las limitaciones de los métodos de genotipado actuales, poniendo de relieve la necesidad de desarrollar nuevas herramientas basadas en las tecnologías de secuenciación de nueva generación (e.g., la secuenciación del genoma completo) que nos permitan obtener información genética mucho más detallada, precisa y resolutiva. Esto podría, a su vez, ayudar a explicar la amplia variabilidad fenotípica observada.