Diseño y desarrollo de plataformas innovadoras para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en ganado porcino

Resumen

La industria porcina genera un tercio de la proteína de origen animal consumida mundialmente y supone la fuente total o parcial de ingresos de millones de personas, lo que la convierte en un sector clave en la economía mundial. Por ello, se hace evidente la necesidad de garantizar la sostenibilidad de dicha producción, así como la seguridad alimentaria y el bienestar animal. Para lo cual un punto clave radica en el control de las enfermedades infecciosas y los agentes causales que afectan a dicha cabaña. La expansión y los cambios estructurales experimentados por este sector han hecho que los agentes patógenos aumenten su difusión y con ello su impacto sobre la industria. Para minimizar dicho impacto, la mejor estrategia es la prevención a través de la implementación de herramientas diagnósticas fiables que permitan trazar la evolución de los patógenos y actuar de manera temprana ante los brotes. En este contexto, el principal objetivo del presente trabajo de tesis ha sido investigar y ampliar las herramientas de diagnóstico directo e indirecto disponibles y complementar aquellas necesidades identificadas en el diagnóstico de enfermedades infecciosas dentro del ganado porcino. En primer lugar, se han desarrollado nuevos métodos de diagnóstico directo para algunos de los patógenos más relevantes para la industria PRVA, SIV, Mycoplasma hyopneumoniae, PCV2 y PRRSV. Para ello las proteínas más inmunogénicas de cada patógeno se expresaron en distintos sistemas heterólogos y se emplearon como diana para la obtención de aptámeros y anticuerpos monoclonales. Los aptámeros son moléculas cortas de ADN o ARN que adquieren una estructura tridimensional tal que les permite reconocer de forma específica a un ligando concreto. Empleando dichos reactivos, se consiguió optimizar in vitro un ensayo tipo ELASA para cada uno de los microorganismos enumerados. Los distintos ensayos ELASA se evaluaron empleando muestras de campo, obteniendo unas sensibilidades comprendidas entre el 40 y el 89 por ciento y unas especificidades comprendidas entre el 73 y el 100 por ciento. Concretamente, el ensayo ELASA optimizado para detección de antígeno de SIV mostró unos resultados que permitieron desarrollar el prototipo como producto comercial. Por otro lado, se obtuvieron anticuerpos monoclonales para el desarrollo de métodos de diagnóstico para la detección de la infección por el ASFV, un patógeno cuya presencia en una zona geográfica concreta, tiene unas enormes implicaciones económicas para la industria. Por este motivo, la puesta a punto de nuevos métodos diagnósticos basados en distintos antígenos del virus tiene un enorme interés para el control y seguimiento de la infección. Empleando un nuevo antígeno recombinante, la proteína VP30, se obtuvieron tres líneas celulares de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales específicos. Los tres AcMs mostraron ser potentes herramientas para el desarrollo de métodos de diagnóstico directo de tipo western blot, inmunofluorescencia y DAS-ELISA. El diagnóstico simultáneo de varias patologías puede solventar la mayor limitación del diagnóstico de laboratorio, la necesidad de una sospecha clínica, y suponer una gran ventaja en términos de rapidez, abaratamiento, capacidades de cribado de elevados números de muestras y facilidad para la aplicación de campañas de vigilancia. Sin embargo se dispone de muy pocos ensayos múltiples comerciales dentro del área veterinaria. Por ello en el presente proyecto se ha trabajado en la puesta a punto de métodos de diagnóstico múltiple, empleando microarrays en suspensión para la detección de anticuerpos específicos frente a algunos de los patógenos de mayor interés epidemiológico dentro de la industria porcina Mycobacterium bovis, SIV, PRRSV, HEV, ASFV y CSFV. El panel sextúple desarrollado mostró ser una potente herramienta para la aplicación de campañas de vigilancia epidemiológica exhibiendo unos buenos parámetros diagnósticos Sn 87 97 por ciento y Sp 92 100 por ciento.