Establecimiento de protocolos de terapias avanzadas, génica y celular, para el tratamiento del déficit de factor v y factor viii de la coagulación

Resumen

Las enfermedades raras o poco frecuentes son aquellas cuya incidencia en la población está por debajo de 1 caso por cada 2000 personas. Muchas de ellas no disponen de un diagnóstico ni de un tratamiento específico y eficaz. Por ello, es necesario la investigación y el desarrollo de nuevos fármacos para este tipo de enfermedades. Las coagulopatías congénitas raras, como son el déficit de factor V o de factor VIII, cursan con hemorragias más o menos graves en función de los niveles del factor de coagulación presente en plasma. En la actualidad solo existen tratamientos paliativos, como el plasma fresco congelado para el déficit de factor V y los concentrados de factor VIII de origen plasmático o recombinante para el déficit de factor VIII. Dado que el plasma fresco congelado es poco eficaz en el déficit de factor V y su utilización es a demanda en base a la necesidad por un episodio hemorrágico, y que los concentrados de factor VIII son de administración intravenosa en régimen de profilaxis, dos o tres dosis a la semana resultando un tratamiento muy tedioso para los pacientes, es absolutamente necesario el desarrollo de un tratamiento curativo a largo plazo que sea capaz, de suplir de forma continuada el factor deficitario, o de corregir el defecto genético. Estos tratamientos curativos solo lo ofrecen las nuevas terapias avanzadas y serían una muy buena alternativa para este tipo de pacientes. Los objetivos de este trabajo están orientados a desarrollar protocolos o estrategias basadas en terapias avanzadas, como la terapia celular y la terapia génica, para tratar de manera eficaz y específica ambas patologías. Una primera estrategia de injerto neonatal de células embrionarias en modelo murino, como fase muy preliminar para terapia celular neonatal, ha demostrado que los tejidos embrionarios con mayor expresión de F5 y F8 son el hígado fetal y la región de la aorta-gónada-mesonefros, respectivamente. Estos tienen un gran potencial de injerto tisular neonatal, pudiendo aumentar los niveles de estos factores en el plasma de los individuos injertados. La estrategia de terapia celular empleada en esta Tesis Doctoral ha demostrado que las células madre mesenquimales de decidua de placenta humana son capaces de diferenciarse a unas estructuras hepáticas tridimensionales llamadas hepatosferas, que son funcionales y son capaces de expresar tanto el gen como la proteína del factor V de la coagulación. Para la estrategia de terapia génica, el trabajo se ha centrado en la edición génica sobre el gen F5 mediante la herramienta CRISPR Cas9, pudiéndose extrapolar todas las técnicas aplicadas al F8 debido a su gran homología y a que comparten las mismas rutas de biogénesis, activación y degradación. Se analizaron las mutaciones en el gen F5, así como la segregación familiar de dos pacientes con déficit severo de factor V. Posteriormente se desarrolló un modelo celular, in vitro, en la línea celular HepG2 mediante CRISPR Cas9, simulando la mutación de una de las pacientes, revirtiendo la mutación mediante la misma técnica. El factor V producido, tras la reversión de la mutación, presentaba función coagulante. Como conclusión, se ha desarrollado y optimizado un protocolo sencillo de diferenciación hepática con la formación de organoides hepáticos tridimensionales, capaces de expresar el gen y la proteína del factor V de la coagulación. Por otro lado, en el estadio 12 del desarrollo embrionario de ratón, el hígado fetal se mostró como el órgano con mayor expresión de F5 y la región aorta-gónada-mesonefro la de mayor expresión de F8, mostrando ambos tejidos un gran potencial de injerto en ratones neonatos. La edición génica mediante la herramienta CRISPR/Cas9, ha resultado muy efectiva para modelizar, in vitro, las mutaciones patológicas exactas en el gen F5 de la paciente. Ha demostrado también su eficacia de un 40% en la corrección de dicha mutación, obteniéndose una proteína nuevamente funcional.