Functional analysis of the effect of nobiletin on preimplantation bovine embryo development

Resumen

La producción in vitro de embriones es una biotecnología reproductiva usada para aumentar el número de descendientes de fenotipos superiores, tratar problemas de infertilidad y conocer las vías metabólicas que modulan el desarrollo embrionario temprano, ya que además del origen del ovocito, aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS), uso de sustancias antioxidantes, y el ambiente de cultivo que afecta la activación del genoma embrionario (EGA), también hay varias vías de señalización responsables de la división y diferenciación celular durante el desarrollo embrionario. En el primer experimento de la tesis observamos que nobiletina tiene un efecto positivo en la maduración in vitro (MIV) de los ovocitos bovinos, aumentando el porcentaje de ovocitos en metafase II, así como la migración de gránulos corticales, actividad mitocondrial, y la producción de blastocistos a día 7 y 8. Además de un incremento en la expresión de los genes: CYP51A1, GJA1, BCL2, BMP15, MAPK1, SOD2 y CLIC1. Y la reducción en los niveles de ROS y GSH. Con este efecto positivo de nobiletina durante la MIV de los ovocitos, en un segundo experimento evaluamos la influencia de nobiletina durante el cultivo in vitro (CIV) en la fase menor (MNEGA: 2-8 células) o mayor (MJEGA: 8-16 células) de EGA y su relación con la vía de señalización AKT. En los resultados, nobiletina aumentó la producción de blastocistos a día 7 y 8, así como la actividad mitocondrial, independientemente de la fase de EGA. Además, aumentó la abundancia de los genes vinculados con el estrés oxidativo, comunicación celular y desarrollo: CDK2, H3-3B, H3-3A, GPX1, NFE2L2 y PPARa en los estadios de 8, 16 células y blastocistos producidos con nobiletina durante la fase MNEGA y MJEGA, y el análisis de inmunofluorescencia reveló proteínas inmunorreactivas para la forma p-AKT (Thr308 y Ser473) en los blastocistos bovinos. Esto indica que nobiletina, durante la EGA tiene un efecto positivo en la calidad y desarrollo embrionario bovino preimplantacional, y este efecto podría ser modulado por la vía de señalización AKT. Por lo que, en un tercer experimento, se evalúo si la suplementación de nobiletina al medio de cultivo durante ambas fases de EGA, influye en el desarrollo y la calidad de los embriones bovinos luego de la inhibición de la cascada de AKT por los inhibidores III o IV. Los resultados revelaron que los inhibidores de AKT reducían el desarrollo embrionario. Pero, la suplementación de nobiletina en ambas fases de EGA recuperó los efectos adversos de los inhibidores de AKT en el desarrollo embrionario y su calidad al aumentar el número de células de los blastocistos y modular la expresión de CDX2, GPX1, NFE2L2, POU5F1 y FOSL1 en embriones tempranos. Además, el nivel de fosforilación de rpS6 (p-rpS6) en los embriones tempranos se redujo con el uso de inhibidores de AKT. Sin embargo, nobiletina fue capaz de recuperar parcialmente este efecto adverso del nivel de p-rpS6. Por lo que, el aumento del nivel de p-rpS6, en presencia o ausencia de inhibidores de AKT, indica que nobiletina probablemente usa otra ruta de señalización además de la vía PI3K/AKT durante el desarrollo embrionario temprano en bovinos. Este es el primer estudio que ha investigado el efecto de la suplementación con nobiletina, un antioxidante natural, durante la MIV y las fases específicas del CIV relacionadas con la EGA sobre el desarrollo y la calidad del embrión bovino, así como su posible interacción con la vía de señalización de AKT. Los efectos positivos de nobiletina, se pueden atribuir a su bioactividad, estructura química y propiedades antioxidantes, y podrían ser una herramienta para superar los trastornos de ROS en los embriones bovinos y mejorar las tecnologías de reproducción asistida en mamíferos. Sin embargo, son necesarios estudios futuros para establecer los receptores específicos y las cascadas genéticas que nobiletina modula durante el desarrollo embrionario in vitro.