El oviductoanálisis transcriptómico, identificación de proteínas secretadas y aplicaciones en reproducción artificial

Resumen

El oviducto es la región anatómica del tracto genital femenino que conecta el útero y los ovarios. Este órgano juega un papel importante en el transporte de gametos y su almacenamiento, incluyendo el reservorio espermático. Además, en él tienen lugar la fecundación y las primeras fases del desarrollo embrionario. En la primera parte de este trabajo se planteó una técnica que permite la separación de subpoblaciones de espermatozoides porcinos en función de su afinidad por azúcares relacionados con el reservorio espermático y se evaluó la capacidad de unión de estos espermatozoides por la zona pelúcida (ZP), para evaluar el potencial de esta selección en técnicas de reproducción asistida. En la segunda parte de la tesis, se llevó a cabo un estudio de transcriptómica del oviducto de la coneja antes y después de la ovulación y durante el desarrollo embrionario preimplantacional para identificar factores clave en cada una de estas etapas. Se empleó la separación celular mediante citometría de flujo (sorting) para seleccionar las subpoblaciones espermáticas porcinas pre-incubadas en medio no capacitante con ovalbúmina y el trisacárido Lewisa fluorescentes. La afinidad por la ZP se evaluó mediante incubación en medio capacitante de cada subpoblación espermática y su correspondiente control con ZPs aisladas a partir de ovocitos aspirados de ovarios obtenidos en matadero. La cantidad de espermatozoides unidos a la ZP se evaluaron con ayuda de Hoescht 33342 mediante microscopía de fluorescencia. Las diferencias temporales en el transcriptoma del oviducto se evaluaron mediante análisis de micromatrices y RT-qPCR, haciéndose las correspondientes preparaciones inmunohistoquímicas y análisis de proteínas secretadas al fluido oviductal (FO) mediante western blot. Los resultados de la primera parte muestran que se puede separar subpoblaciones espermáticas en función de su afinidad por sondas glucídicas, y que estas poblaciones tienen diferente afinidad por la ZP, lo que les confiere diferente capacidad para fecundar un ovocito. Los resultados del análisis mediante micromatrices muestran un total de 602 transcritos diferencialmente expresados entre las etapas analizadas (pre-ovulatoria, post-ovulatoria, oviducto con embriones de ocho células y oviducto con mórulas). Además, se identificaron tres proteínas del (FO) con una expresión diferente durante las etapas estudiadas: la osteopontina (SPP1), cuya expresión es mayor en la etapa post-ovulatoria (en presencia de zigotos); el neuropéptido Y (NPY), secretado antes de la ovulación; la metalopeptidasa 7 (MMP7), que deja de expresarse en las últimas fases del desarrollo pre-implantacional. Como conclusiones de la primera parte de la tesis: 1) existen varias subpoblaciones espermáticas con distintas afinidades por azúcares que poseen diferente afinidad por la ZP, 2) es posible separar las subpoblaciones espermáticas en base a su afinidad por glicoconjugados mediante sorting, pero su afinidad por la zona pelúcida se compromete, 3) es necesario implementar un método de separación diferente al de sorting que no disminuya la afinidad de los espermatozoides por la zona pelúcida. En cuanto a la segunda parte de la tesis: 1) el transcriptoma del oviducto de la coneja presenta diferencias espaciales y temporales durante la ovulación y el desarrollo embrionario pre-implantacional; 2) Varias proteínas del FO varían entre la cópula y el final del desarrollo embrionario pre-implantacional, incluyendo SPP1, NPY y MMP7; 3) La respuesta a la ovulación y la cópula presenta ciertos mecanismos moleculares conservados entre diferentes especies de mamíferos, favoreciendo la expresión de SERPINE1, SPP1 y PTGS2; 4) La respuesta del oviducto de los mamíferos a la presencia de embriones involucra una modulación local del sistema inmune. Aún así, no se ha esclarecido un mecanismo de respuesta universal debido a la discrepancia de resultados entre especies.