Different Modes of Synaptic Vesicle Recycling un Synaptophysin-pHluorin Transgenic Mouse Motor Nerve Terminals

Resumen

En el presente trabajo, se ha generado una nueva herramienta para el estudio de la exo- y endocitosis en tiempo real (el ratón SypHy) con el objetivo de estudiar la organización funcional y estructural en un modelo de sinapsis de vertebrados, la unión neuromuscular del ratón transgénico SypHy. Para ello se han combinado técnicas de imagen de fluorescencia, registros electrofisiológicos e inmunofluorescencia La unión neuromuscular es una sinapsis que debe exocitar un gran número de vesículas sinápticas para garantizar la efectiva excitación de las fibras musculares postsinápticas. Para ello, el terminal nervioso motor debe ser capaz de reutilizar las vesículas previamente exocitadas mediante endocitosis. En el mismo terminal motor es posible que coexistan diferentes modos de endocitosis, sin embargo, la contribución relativa de cada uno de estos modos y sus mecanismos de regulación no están completamente claros. En la primera parte de este trabajo, se ha usado dynasore, un bloqueante de la actividad GTPasa de dinamina 1/2, para investigar la contribución de dinamina en la endocitosis durante y después de trenes de estímulos a alta frecuencia. Si la endocitosis durante el estímulo depende de dinamina 1/2, SypHy permanecería en la membrana plasmática y la fluorescencia sería mayor en presencia de la droga. Por otro lado, si la dinamina 1/2 es activada después del estímulo la respuesta de fluorescencia se enlentecería. Los experimentos realizados sugieren que la dinamina 1/2 sólo participa modestamente en la endocitosis durante el estímulo con una activación tiempo dependiente. Después del estímulo, sin embargo, la dinamina 1/2 se activa rápidamente. Además se ha demostrado que tanto dimanina 1 cómo dinamina 3 se expresan en los terminales motores adultos. En la segunda parte de este trabajo, se ha estudiado el rol de calcineurina en la exo- y endocitosis. Se ha encontrado que calcineurina es esencial tanto para la exo- como la endocitosis en una población de terminales motores. En presencia de FK506 o CsA, dos inhibidores específicos de calcineurina, tanto los potenciales de placa evocados cómo la señal de fluorescencia se afectaron de manera concentración dependiente. Por último, en la tercera parte de este trabajo, se ha estudiado la organización de las zonas activas en los terminales motores de ratones adultos y durante el desarrollo postnatal. Con este objetivo, se cuantificaron las zonas activas marcadas inmunofluorescentemente con anticuerpos anti basson y anti piccolo, dos proteínas de andamiaje de las zonas activas. Se ha encontrado que el número de zonas activas aumenta exponencialmente desde el día postnatal 2 hasta la edad adulta, sin embargo, la densidad de las zonas activas permanece contante durante el proceso de maduración.