Estudio de la a-glucosidasa de Schwanniomyces occidentalis para la síntesis de isomaltooligosacáridos y otros compuestos glucosilados

Resumen

La GAM1 de Scwanniomyces occidentalis es una α-glucosidasa extracelular que hidroliza enlaces α1-4 glucosídicos de oligosacáridos formados por unidades de glucosa como la maltosa o la maltotriosa. Además, esta enzima es capaz de transferir unidades de glucosa para formar isomaltooligosacáridos (IMOs) como la isomaltosa, isomaltotriosa y panosa que tienen interés en la industria alimentaria por sus características prebióticas. La enzima también produce maltotriosa. En este trabajo la α-glucosidasa GAM1 se expresó heterólogamente en Pichia pastoris, se realizó su caracterización bioquímica y se estudió su capacidad para sintetizar IMOs en distintas condiciones. Entre ellas, y tras la adición de distintas concentraciones de glucosa, se logró sesgar la especificidad transferasa de la enzima hacia la producción de azúcares que contienen solamente enlaces α1-6, sobre todo isomaltosa, quedando inhibida la síntesis de los trisacáridos panosa y maltotriosa. Se exploró la capacidad de GAM1 para glucosilar distintos tipos de aceptores, entre ellos azúcares y polifenoles, logrando producir varios trisacáridos formados por la unión de una glucosa a sacarosa mediante distintos tipos de enlaces a la unidad de glucosa, y disacáridos de glucosil-xilosa en los que se formaron distintos tipos de enlace entre las unidades constituyentes. GAM1 glucosiló también piceido, un derivado monoglucosilado del resveratrol, generando mono- y diglucósido del piceido, en los que las unidades de glucosa se unieron a la unidad glucosídica del aceptor. Los nuevos productos generados fueron purificados y su estructura identificada mediante RMN. Se estudió también la estructura tridimensional de GAM1 mediante modelados por homologías y se abordó el estudio de su especificidad utilizando Evolutionary Trace y mutagénesis dirigida hacia residuos de su bolsillo catalítico implicados en los subsitios -1, +1 y +2. La mayoría de las sustituciones realizadas afectaron en mayor o menor medida a la capacidad transferasa de la enzima que alteraron las proporciones producidas de IMOs. Una de las sustituciones en particular incrementó especialmente la producción de IMOs hasta prácticamente duplicarla, principalmente la de isomaltosa e isomaltotriosa, además produjo pequeñas cantidades de un nuevo disacárido formado por dos unidades de glucosas unidas por enlace α1-1, la trehalosa. Por último, abordamos la inmovilización de GAM1 sobre bolas de quitosano utilizando dos linkers diferentes (glutaraldehído y genipina), se optimizaron las condiciones de la inmovilización y se analizó tanto la estabilidad operacional del sistema como a distintos valores de pH y temperatura. La estabilidad operacional para las reacciones de transglicosilación fue superior al usar glutaraldehído.