Biotransformaciones catalizadas por enzimas multiméricas: ingeniería del biocatalizador

Resumen

En los últimos años, el uso de enzimas en la industria como biocatalizadores se ha ido incrementando, esto se debe a las excelentes propiedades de las enzimas, como altas actividades catalíticas y altas selectividades, que las hacen grandes candidatas para sustituir los procesos químicos convencionales. Pero, por lo general, las enzimas no son estables en las condiciones de reacción industriales, por lo que es necesaria su mejora antes de incorporarlas a procesos industriales. Una técnica relativamente sencilla y de bajo coste, que permite la mejora de la estabilidad de las enzimas es su inmovilización sobre un soporte rígido que, además, tiene la ventaja adicional de que permite su reutilización. La inmovilización por unión covalente multipuntual sobre soportes activados por aldehídos, como la agarosa glioxil, ha demostrado ser una excelente técnica de inmovilización para promover aumentos de estabilidad de proteínas. El objetivo de esta Tesis Doctoral fue la preparación de diversos biocatalizadores de enzimas multiméricas mediante unión covalente multipuntual y su uso en biotransformaciones. Se pondrán de manifiesto los problemas de inmovilizar enzimas multiméricas mediante esta metodología, como pueden ser, sensibilidad a la rigidificación de su estructura, inactivación del cofactor o inactivación por borohidruro de sodio, etapa imprescindible en esta metodología. Desarrollar soluciones a este tipo de problemas es de una gran importancia debido a la cada vez mayor cantidad y complejidad de enzimas empleadas en procesos industriales. Se inmovilizó y estabilizó, más de 60 veces, una sacarosa sintasa sensible a rigidificación de su estructura cuaternaria, y se empleó el mejor biocatalizador inmovilizado en la producción de UDP-glucosa. Se produjeron tres α-cetoácidos diferentes gracias a un sistema trienzimático inmovilizado mediante resolución cinética dinámica de una mezcla racémica del correspondiente aminoácido, la cual, se pudo llevar a cabo con un biocatalizador inmovilizado de una aminoácido racemasa de Vibrio cholerae PLP-dependiente, que mantuvo el enlace aldimida intacto entre el cofactor y la enzima, con un aumento de la estabilidad de más de 3000 veces. También se caracterizó, inmovilizó y estabilizó una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Thermus thermophilus HB27, el biocatalizador óptimo fue 470 veces más estable en condiciones de reacción. Por último, se desarrolló una metodología alternativa de reducción empleando un agente reductor quimioselectivo de bases de Schiff: el 2-picolino borano. Mediante esta reducción alternativa, se co-inmovilizó una mandelato deshidrogenasa bacteriana y una formiato deshidrogenasa de Candida boidinii, y se aplicó este biocatalizador co-inmovilizado en la producción de ácido (R)-mandélico. Además, gracias a esta técnica, se consiguió generar microambientes hidrofílicos sobre soportes hidrofóbicos, como son los derivados del metacrilato, eliminando los efectos negativos que proporcionan este tipo de superficies a las enzimas inmovilizadas.