Mechanistic characterization of p62 as a driver of melanoma metastasis

Abstract

Summary Cutaneous melanoma is the most aggressive form of skin cancer. The aggressive nature of this disease is manifested by the fact that lesions of barely 2 mm in depth already bear a high potential for metastasis. High throughput analyses have identified recurrent alterations in oncogenic pathways (i.e involving BRAF, NRAS, PI3K>AKT, NF1 or NOTCH, among others) that have paved the way for the development of molecularly-targeted therapies. However, melanoma is also a prime example of how a complex (epi)genome can activate compensatory protective responses (also against recently-approved immune checkpoint blockers). A rather unexplored strategy to search for putative tumor drivers is to focus on lineage-specific oncogenic dependencies rather on common cancer hallmarks conserved with other malignancies. In melanoma, these lineage-specific oncogenes have been traditionally linked to melanosome and pigmentation pathways. However, our group has recently identified new signalling cascades distinctively enriched in melanoma cells. These include specific RNA binding proteins (CPEB4, UNR), as well as over 30 endolysosomal factors. Analysis of autophagy, another lyososmal-associated process also revealed selective heterozygous loses in ATG5 as a feature favouring poor patient prognosis. p62/SQSTM1 (sequestosome 1) was an attractive candidate to pursue for its known links in autophagy and as a signaling hub for multiple protein-protein complexes. Importantly, although p62 has been found accumulated in a broad spectrum of tumor types, there is no clear consensus on whether it acts as a tumor promoting or tumor suppressive agent, particularly in the context of metastasis. Here we present a comprehensive analysis of p62 expression and functional requirement in melanoma cells, clinical biopsies and newly generated genetically engineered mouse models. This strategy was used to assess key pending questions in this field such as: (i) what is the relative impact of p62 copy number in the stroma vs benign and malignant melanocytic lesions, particularly in the context of metastasis; (ii) does p62 share autophagy and non-autophagy roles with other tumor types, or (iii) does it act in a tumor-specific manner?, and if so, (iv) what are the underlying mechanisms. To this end, particular attention was dedicated to genome-wide analyses of the p62 interactome and its global impact on the transcriptome and proteome of melanoma cells. Computational analyses, studies in GEMM and proteomic analyses were also performed in comparison to ATG5. In addition, targeted gene depletion was exploited to assess best known functions of p62 as a signaling hub. Together, this integrated approach revealed a distinct impact of p62 in the control of melanoma-enriched gene networks. Finding an unexpected role of p62 opposing mRNA decay of FERMT2 and other pro-metastatic factors, our data ultimately revealed a new function of p62 as a hub of RNA binding proteins. Together, the results of this PhD thesis offer a platform for tumor-type specific functions of p62 in cancer.   Resumen El melanoma cutáneo es la forma más agresiva y letal de cáncer de piel, tanto es así, que lesiones de menos de 2 mm de grosor ya poseen una gran capacidad metastásica. A través del desarrollo de múltiples análisis a gran escala se ha se han podido identificar una serie de alteraciones recurrentes en diversas rutas de señalización oncogénicas (BRAF, NRAS, PI3K >AKT, NF1 y/o NOTCH entre otros), lo que ha facilitado el desarrollo de terapias genéticamente dirigidas. A pesar de ello, el melanoma es uno de los mejores ejemplos de cómo un (epi) genoma tan complejo y con tal número de alteraciones, puede resultar en la activación de mecanismos compensatorios de adaptación y protección frente a los tratamientos vigentes. Una estrategia aún poco explorada en la identificación de nuevas dianas pro-oncogénicas es el estudio restringido de las dependencias oncogénicas asociadas a linaje, en lugar de perseguir alteraciones comunes a otros tipos de tumores. En melanoma estos oncogenes específicos de linaje se han asociado clásicamente a rutas de pigmentación y producción de melanosomas. Sin embargo nuestro grupo ha identificado nuevas rutas de señalización selectivamente enriquecidas en melanoma. Entre sus componentes se han encontrado proteínas de unión a RNA (CPEB4, UNR) y más de 30 proteínas endolisosomales. Por otro lado, estudios previos de nuestro grupo sobre autofagia, un proceso asociado a los lisosomas, muestran que la pérdida selectiva de una copia del gen que codifica para la proteína ATG5 se encuentra asociada a un pronóstico desfavorable en pacientes. Por todo lo anteriormente mencionado, p62/SQSTM1 (sequestosoma 1) se presenta como un candidato atractivo en melanoma, tanto por su relevante función en autofagia, como por funcionar como plataforma de señalización en numerosos tipos tumorales. Sin embargo, aunque se ha observado que p62 se encuentra sobre-expresado en múltiples tipos de cáncer, aún no existe un consenso sobre su papel como promotor o supresor tumoral, particularmente en metástasis. Por todo ello, esta tesis se planteó con los siguientes objetivos: (i) determinar del impacto en el número de copias de p62, tanto en el estroma tumoral como en lesiones melanocíticas (benignas y malignas), y particularmente en melanoma metastásico; (ii) definir si las funciones de p62, en autofagia y otros procesos celulares, son específicos en melanoma o comunes a otros tumores (iii), y por último, (iv) caracterizar el mecanismo de acción específico en melanoma. Para responder a estas cuestiones se ha realizado un exhaustivo análisis de la función de p62 en líneas celulares de melanoma, biopsias clínicas y modelos animales modificados genéticamente. A su vez, se ha dedicado especial énfasis al interactoma de p62 y al impacto que esta proteína tiene en el transcriptoma y proteoma celular. En paralelo, se ha analizado mediante estudios de proteómica y computacionales el papel de p62 y ATG5 en animales modificados genéticamente para ambos genes. Y por último, mediante ensayos de pérdida de función, se ha caracterizado la función de p62 como plataforma de señalización. Integrando las aproximaciones anteriormente descritas, se ha descubierto que p62 tiene un papel protector en la estabilidad del mRNA de FERMT2 y otros factores pro-metastásicos, por lo que se describe por primera vez la función de p62 como plataforma de señalización a través de proteínas de unión a RNA (RBPs). En conjunto, estos resultados revelan nuevas funciones de p62 y determinan su especificidad en melanoma.