Terapia celular con sirna anticd40 en un modelo de daño renal agudo (uropatía obstructiva reversible -uuor) en ratones de cepa c57bl/6j

Resumen

Antecedentes del tema La insuficiencia renal aguda de causa obstructiva es una patología muy frecuente, pudiendo la fibrosis y la inflamación producida llevar a la pérdida completa de la función renal. La señalización CD40-CD40L es una molécula co-estimuladora que pertenece a la superfamilia del factor de necrosis tumoral y que inicia una cascada de señalización que activa una fuerte respuesta inflamatoria inmune. Diversos estudios han demostrado los efectos terapéuticos de su bloqueo mediante un mecanismo de interferencia génica RNA contra CD40, que inhibe eficazmente la traducción del mismo, llamado siRNA anti-CD40 específico, por lo que se ha convertido en un nuevo objetivo emergente. Hipótesis Con el fin de investigar el efecto del bloqueo del CD40 con siRNA vamos a administrar esta sustancia en un modelo de daño renal agudo de Uropatía Obstructiva Reversible, siendo nuestra hipótesis que este bloqueo reduciría el estado inflamatorio en el desarrollo de insuficiencia renal aguda de causa obstructiva. Por lo tanto, el silenciamiento génico del CD40 con siRNA podría surgir como una nueva estrategia terapéutica en este tipo de patología. Objetivos •Estudio 1: Realizar un modelo de Uropatía Obstructiva Reversible (rUUO) en ratones que se utilize para estudiar la recuperación estructural y funcional de los riñones tras el alivio de la obstrucción con un potencial prominente para el estudio de los procesos inflamatorios inmunes, celulares y de regeneración tisular. •Estudio 2: Evaluar si el bloqueo de la señalización de la coestimulación CD40-CD40L mediante la administración de siRNA-CD40 tendría un efecto terapéutico en la lesión renal inducida por nefropatía obstructiva reduciendo la respuesta inflamatoria y el daño renal en un modelo de rUUO en ratones. Metodología •Estudio 1: Se dividieron ratones machos C57BL/6J de ocho semanas de edad en cinco grupos (n=5 cada uno): UUO día 1, 2, 3, 4 y 5. rUUO se realizó con un clamp microvascular. En el día 3, se retiró el clamp ureteral y se realizó nefrectomía del riñón contralateral. Los ratones se sacrificaron 48 h después (día 5). Se agregó un grupo adicional con nefrectomía unilateral sin UUO. Se usaron ratones Wild Type como controles. Se recogieron muestras de sangre y tejido para análisis de creatinina, inmunohistoquímica y expresión génica mRNA renal. •Estudio 2: Se dividieron ratones machos C57BL/6J de ocho semanas de edad en cuatro grupos: Vehículo (PBS, solución salina tamponada con fosfato) (n=8); siRNA SC (siRNA no específico) (n=6); SiRNA-CD40 (n=8) y WT (Wild Type) (n=6). La UUO se realizó con un clamp microvascular. En el día 3 después de la cirugía, se retiró el clamp ureteral y se realizó nefrectomía del riñón contralateral. Inmediatamente, se administró PBS, siRNA SC (50 µg) o siRNA-CD40 (50 µg) a través de la vena de la cola. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la administración del siRNA o solución salina. Se usaron ratones Wild Type como controles. Se recogieron muestras de sangre para medir la creatinina y el nitrógeno ureico en sangre (BUN). Se realizó histología y expresión génica mRNA renal. Resultados: •Estudio 1: En el análisis del riñón obstruido observamos lesión renal aguda evaluada por creatinina que duplicaró su valor basal; signos histológicos de daño tubular; aumento de la respuesta inflamatoria evaluada por macrófagos F4/80; regulación positiva de las citocinas pro-inflamatorias y pro-fibróticas como IL-2, MCP-1, CD40 y TGF-β1; y aumento de la tinción de actina del músculo liso α, y leve fibrosis. Una vez que se retiró el clamp, se observó mejoría de la función renal, de las lesiones histopatológicas y de la respuesta inflamatoria. •Estudio 2: La administración de siRNA-CD40 redujo significativamente la gravedad de la insuficiencia renal aguda asociada con UUO. El análisis histopatológico mostró en los animales tratados con siRNA-CD40: reducción de la dilatación tubular, de la fibrosis intersticial, de los macrófagos F4/80 e infiltración de CD3 (células T). Además, el análisis de la expresión génica del mARN renal mostró niveles significativamente más bajos de marcadores de macrófagos (F4/80 y receptor de manosa), proteínas de fibrosis de la matriz (Fibronectina, MMP-9, Colágeno IV y α-SMA), citocinas pro-inflamatorias (iNOS y MCP-1) y de la molécula pro-fibrótica TGF-β1, en siRNA-CD40. Conclusiones: 1.El modelo de Uropatía Obstructiva Reversible mediante clampaje ureteral de tres días de obstrucción que incluye la nefrectomía del riñón contralateral, es un método válido, simple, reproducible y fiable, que se puede utilizar para estudiar la recuperación estructural y funcional de los riñones tras el alivio de la obstrucción con un potencial prominente para el estudio de los procesos inflamatorios inmunes, celulares y de regeneración tisular. 2.El bloqueo de la señalización coestimuladora CD40-CD40L mediante la administración de siRNA-CD40 reduce la respuesta inflamatoria y el daño renal, teniendo un efecto terapéutico protector y curativo en la nefropatía obstructiva en un modelo de daño renal agudo reversible.