Evaluating inorganic nanoparticles in the living organism Caenorhabditis elegans

Resum

En aquesta tesi hem utilitzat el model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans) com a sistema biològic viu per avaluar nanopartícules (NPs) per aplicacions biomèdiques. En concret, hem avaluat el comportament de dos tipus de partícules inorgàniques amb diferent mida i propietats de superfície: NPs d’òxid de ferro (SPIONs) recobertes de citrat i d’albúmina sèrica bovina (BSA), i NPs d’or recobertes de citrat de dos mides diferents (10 nm i 150 nm). Hem estudiat les interaccions nano-bio en C. elegans amb especial atenció en les propietats dels materials in vivo incloent el seu estat, ingesta, localització, efectes biològics i mecanismes moleculars. Amb aquest propòsit, hem combinat assajos de toxicitat, tècniques de ciència de materials i d’imatge, i anàlisi de l’expressió gènica. També hem investigat la influència de la composició de les NPs, del seu recobriment superficial i de la seva mida in vivo, i comparat els nostres resultats amb estudis previs. És destacable el fet d’haver pogut realitzar totes aquestes avaluacions biològiques en el mateix laboratori on hem sintetitzat i caracteritzat les partícules gracies als avantatges experimentals de C. elegans. Així doncs, aquesta tesi valida l’ús de C. elegans com a un model animal senzill per avaluar NPs en les etapes inicials de desenvolupament. A través de tècniques de microscòpia, vam veure que les NPs entraven al cos del cuc durant el procés d’alimentació i s’acumulaven seguint patrons particulars segons les propietats de les NPs. Les NPs d’or no eren internalitzades per les cèl·lules intestinals de C. elegans, mentre que vam poder identificar NPs d’òxid de ferro en el compartiment lisosomal d’aquestes cèl·lules. En cap cas vam detectar translocació de NPs a òrgans secundaris, ni entrades per altres vies (ex. dermal) o orificis del cos. Per caracteritzar el perfil toxicològic de les NPs, vam estudiar diferents paràmetres toxicològics letals i sub-letals. Vam observar que la LD50 de les NPs d’òxid de ferro casi doblava (600 µg/ml) el valor de les NPs d’or de 11 nm (350 µg/ml), cosa que indica que les NPs d’òxid de ferro són més biocompatibles que les d’or. Les SPIONs recobertes de BSA van afectar l’estat de C. elegans menys que les recobertes de citrat, suggerint un efecte protector pel recobriment del BSA. De manera similar, vam veure que les NPs d’or de 150 nm eren menys tòxiques que les de 11 nm, cosa que indica que la mida de les NPs és rellevant pels seus efectes in vivo. L’ús de tècniques fisicoquímiques ens va permetre quantificar la ingesta de NPs per part del cuc i ens va permetre també caracteritzar l’estat de les NPs en C. elegans. Dins de l’animal, les SPIONs mantenien les seves propietats magnètiques inicials però eren parcialment degradades en l’intestí, especialment les recobertes de citrat, amb el conseqüent alliberament de ions ferro. Les NPs d’or van resultar més resistents a la degradació però vam observar cert grau d’agregació, que era reversible i depenia de la regió de l’intestí on es localitzaven les NPs. Mitjançant experiments in vitro, vam confirmar que el pH i la presència de biomolècules en l’intestí pot contribuir a determinar l’estat de les NPs in vivo. D’altra banda, vam estudiar i identificar mecanismes moleculars afectats per l’exposició a NPs a través de tècniques genètiques. Vam observar que les NPs alteraven els mecanismes d’estrès oxidatiu i de detoxificació de metalls, cosa que suggereix que estan implicats en la resposta de C. elegans a les NPs. En el cas de les SPIONs, vam detectar efectes depenent del recobriment: mentre que les partícules recobertes de citrat afectaven el processament d’informació ambiental i genètica, les recobertes de BSA afectaven el funcionament metabòlic. En conjunt, creiem que el tractament amb NPs és capaç d’activar mecanismes d’estrès general i també rutes específiques que depenen de les propietats de les NPs. En resum, aquesta tesi ha contribuït a: i) ampliar el ventall de tècniques utilitzades per caracteritzar interacciones nano-bio en C. elegans; ii) una avaluació sistemàtica i extensa de les interacciones entre NPs y C. elegans, des de la síntesi del material fins l’anàlisi dels mecanismes moleculars; i iii) estudiar la influencia de las propietats de les NPs en els seus efectes in vivo. En esta tesis hemos usado el modelo animal Caenorhabditis elegans (C. elegans) como sistema biológico vivo en el que evaluar nanopartículas (NPs) para aplicaciones biomédicas. En concreto, hemos evaluado el comportamiento de dos tipos de partículas inorgánicas con diferentes tamaños y propiedades de superficie: NPs de óxido de hierro (SPIONs) recubiertas de citrato y de albúmina sérica bovina (BSA), y NPs de oro recubiertas de citrato de dos tamaños distintos (10 nm y 150 nm). Hemos estudiado las interacciones nano-bio en C. elegans con especial atención en las propiedades de los materiales in vivo incluyendo su estado, ingestión, localización, efectos biológicos y mecanismos moleculares. Con esta finalidad, hemos combinado ensayos de toxicidad, técnicas de ciencia de materiales y de imagen, y análisis de la expresión génica. También hemos investigado la influencia de la composición de las NPs, de su recubrimiento superficial y de su tamaño in vivo, y comparado nuestros resultados con estudios previos. Es destacable el hecho de haber podido realizar todas estas evaluaciones biológicas en el mismo laboratorio donde hemos sintetizado y caracterizado las partículas gracias a las ventajas experimentales de C. elegans. De este modo, esta tesis valida el uso de C. elegans como un modelo animal simple para evaluar NPs en las etapas iniciales de desarrollo. A través de técnicas de microscopía, vimos que las NPs entraban al cuerpo del gusano durante el proceso de alimentación y se acumulaban siguiendo patrones particulares según las propiedades de las NPs. Las NPs de oro no eran internalizadas por las células intestinales de C. elegans, mientras que detectamos SPIONs en el compartimento lisosomal de estas células. En ningún caso detectamos translocación de NPs a órganos secundarios, ni entrada por otras vías (ej. dermal) u orificios del cuerpo. Para caracterizar el perfil toxicológico de las NPs, estudiamos diferentes parámetros toxicológicos letales y sub-letales. Observamos que la LD50 de las SPIONs casi doblaba (600 µg/ml) el valor de las NPs de oro de 11 nm (350 µg/ml), lo cual indica que las SPIONs son más biocompatibles que las de oro. Las BSA-SPIONs afectaron el estado de C. elegans menos que las C-SPIONs, sugiriendo un efecto protector del recubrimiento de BSA. De forma similar, vimos que las NPs de oro de 150 nm eran menos tóxicas que las de 11 nm, lo cual indica que el tamaño de las NPs es relevante para sus efectos in vivo. El uso de técnicas fisicoquímicas nos permitió cuantificar la ingesta de NPs por parte del gusano y nos permitió también caracterizar el estado de las NPs en C. elegans. Dentro del animal, las SPIONs mantenían sus propiedades magnéticas iniciales pero eran parcialmente degradadas en el intestino, especialmente las recubiertas de citrato, con la consiguiente liberación de iones hierro. Las NPs de oro resultaron más resistentes a la degradación pero observamos cierto grado de agregación, que era reversible y dependía de la región del intestino donde se localizaban las NPs. Mediante experimentos in vitro, confirmamos que el pH y la presencia de biomoléculas en el intestino puede contribuir a determinar el estado de las NPs in vivo. Por otro lado, estudiamos e identificamos mecanismos moleculares afectados por la exposición a NPs usando técnicas genéticas. Observamos que las NPs alteraban los mecanismos de estrés oxidativo y de detoxificación de metales, lo cual sugiere que están implicadas en la respuesta de C. elegans a las NPs. En el caso de las SPIONs, detectamos efectos dependientes del recubrimiento: mientras que las partículas recubiertas de citrato afectaban el procesamiento de información ambiental y genética, las recubiertas de BSA afectaban el funcionamiento metabólico. En conjunto, creemos que el tratamiento con NPs es capaz de activar mecanismos de estrés general y también rutas específicas que dependen de las propiedades de las NPs. En resumen, esta tesis ha contribuido a: i) extender el abanico de técnicas usadas para caracterizar interacciones nano-bio en C. elegans; ii) una evaluación sistemática y extensa de las interacciones entre NPs y C. elegans, desde la síntesis del material hasta el análisis de mecanismos moleculares; y iii) estudiar la influencia de las propiedades de las NPs en sus efectos in vivo. In this thesis, we have used the simple model organism Caenorhabditis elegans (C. elegans) as an in vivo biological system to screen nanoparticles (NPs) proposed for biomedical uses. In particular, we have assessed the behaviour of two types of inorganic particles with different size and surface properties: iron oxide NPs (SPIONs) coated with citrate and bovine serum albumin (BSA), and citrate coated gold nanoparticles of two different diameters (11 nm and 150 nm). We have studied their nano-bio interactions in C. elegans with special focus on the material’s properties in vivo including their status, uptake, fate, biological effects and molecular mechanisms. To this end, we have combined toxicity tests, materials science and imaging techniques, and gene expression analysis. We have also investigated the influence of NP composition, coating and size in vivo, and compared our results with previous studies. Remarkably, we have been able to perform this biological evaluation in the synthetic laboratory where the particles were synthesized and characterised due to the advantageous experiments features of C. elegans. Therefore, our work sets up C. elegans as a simple animal model to evaluate NPs in the initial stages of development. By microscopy techniques, we found that NPs entered the body of the worm during feeding and accumulated in the intestine with particular patterns depending on the NP properties. Gold NPs were not internalized by the C. elegans intestinal cells, while iron oxide NPs were identified in the lysosomal compartment of these cells. We did not detect translocation of NPs to secondary organs, either entrance by other routes (i.e. dermal) or body openings. Lethal and sub-lethal endpoints were analysed to characterise the toxicological profile of the NPs. We found that the LD50 of iron oxide NPs almost doubled (600 µg/ml) the value for 11-nm gold NPs (350 µg/ml) indicating the superior biocompatibility of the former. BSA-coated SPIONs affected to a lesser extent the behaviour of C. elegans than citrate-coated SPIONs, suggesting a protective effect of the BSA coating. Similarly, 150-nm gold NPs appeared less toxic than their smaller counterparts, indicating that NP size is relevant to their in vivo effects. The use of physicochemical techniques allowed us to quantify the ingestion of NPs by C. elegans and, interestingly, we could also characterise NP status inside C. elegans. We found that iron oxide NPs maintained their initial magnetic properties but were partially degraded inside the intestine, especially the citrate-coated particles, with the consequent release of iron ions. Gold NPs appeared resistant to degradation but showed some degree of aggregation, which was reversible and depended on the specific area of the gut. We confirmed in vitro that the pH and presence of biomolecules in the intestine could contribute to determine the status of the NPs in vivo. We also investigated potential molecular mechanisms affected by NP exposure using genetic tools. We observed that NP treatment disrupted the oxidative stress and metal detoxification pathways, suggesting that they might be involved in the response of C. elegans to NPs. In the case of iron oxide NPs, we found coating-dependent effects: citrate-coated particles affected the processing of environmental and genetic information, while BSA-coated SPIONs affected metabolic mechanisms. All in all, we believe that NP treatment can trigger general stress mechanisms and also specific pathways depending on the NP properties. In conclusion, this thesis contributes to: i) extend the toolkit of techniques used for the characterisation of nano-bio interactions in C. elegans; ii) a systematic and comprehensive evaluation of the interaction of NPs in C. elegans, from the materials’ synthesis to the analysis of molecular pathways; and iii) study the influence of NP properties on their in vivo effects.