Proteome characterization of Brachyspira strainsidentification of bacterial antigens /

Resumen

Título de la tesis: Caracterización proteómica de cepas de Brachyspira. Identificación de antígenos bacterianos. El género Brachyspira incluye varias especies patogénicas que afectan a cerdos, perros, pájaros y humanos. En cerdos, Brachyspira (anteriormente Serpulina y Treponema) hyodysenteriae y Brachyspira pilosicoli son patógenos intestinales bien conocidos. Estas especies son espiroquetas gram-negativas, flageladas y anaeróbicas, las cuales viven en el intestino grueso y que tienen una asociación estrecha con la mucosa del colon. Brachyspira hyodysenteriae es el agente causante de la disentería porcina, mientras que Brachyspira pilosicoli está relacionada con la espiroquetosis intestinal, una colitis más leve, no hemorrágica. La disentería porcina es una enfermedad con un impacto importante en la producción porcina debido a los costes vinculados a la mortalidad, morbididad, la producción ineficiente y la medicación de los animales. Aunque la enfermedad puede afectar animales de todas las edades, afecta raramente a lechones menores de tres semanas, produciéndose más frecuentemente durante los periodos de crecimiento y finalización, lo cual agrava las pérdidas económicas. Las estrategias para tratar estas enfermedades se basan principalmente en el uso de antibióticos como Tiamulin, Valnemulin, Tylosin, Tylvalosin o Lincomycin. Desafortunadamente, cepas resistentes a antibióticos han sido detectadas para ambas especies en diferentes países alrededor del mundo. A pesar de que hace mucho tiempo que se conoce el hecho de que los cerdos que se recuperan de una infección desarrollan Resistencia contra Brachyspira hyodysenteriae, no hay una vacuna disponible todavía. Los genomas de estas especies están disponibles desde los años 2009-2010, pero la información a nivel proteómico todavía es escasa. En este trabajo se presenta la caracterización de los proteomas de estos patógenos. Se proporciona evidencia experimental del perfil de expresión proteica en estas especies, incluyendo PTMs y SAS, y se ha llevado a cabo en el contexto de la búsqueda de potenciales candidatos para elaborar una vacuna. Esta caracterización se ha llevado a cabo a través del estudio del proteoma total, el proteoma expuesto y el inmunoproteoma de cepas comerciales y aislados de estas especies. - El proteoma total fue estudiado a través de una aproximación proteómica shotgun, usando una serie de herramientas informáticas dirigidas a optimizar la cantidad de información sobre la secuencia obtenida de los datos espectrométricos. En una primera etapa, los espectros fueron analizados con una combinación de seis motores de búsquedas diferentes usando la aplicación PeptideShaker. Aquellos espectros que no se identificaron en esta primera etapa fueron analizados con una combinación de novo y búsqueda en base de datos con motor de búsqueda usando la aplicación PEAKS. Las secuencias que no se identificaron después de esta etapa se buscaron en BLAST frente a base de datos de Brachyspira total y de mamíferos. En resumen, más de 1500 proteínas fueron identificadas para cada especie. La cobertura del proteoma estimada fue 67-70%. Además, se ha descrito el perfil de PTM, siendo la metilación la modificación más frecuente. A través del enriquecimiento especifico se identificaron 79 y 91 sitios de fosforilación, y 3221 y 5579 sitios de acetilación para B. hyodysenteriae y B. pilosicoli, respectivamente. - El proteoma expuesto fue estudiado usando sobrenadantes celulares y muestras obtenidas después de un tratamiento enzimático controlado de las células intactas. Entre las proteínas más abundantes identificadas en el proteoma expuesto hay proteínas relacionadas con movimiento/chemotaxis, proteínas ribosomales, enolase, NADH oxidasa, y Heat Shock Proteins. - El inmunoproteoma fue caracterizado por immunoblot de las proteínas de bacteria con suero de cerdos experimentalmente infectados. Se identificaron once proteínas inmunoreactivas para B. hyodysenteriae y 8 para B. pilosicoli. Dos de estas proteínas, enolase y PEPCK fueron identificadas como inmunoreactivas en las dos especies.