Nuevos derivados de quitosano funcionalizados en el grupo amino, de alto valor añadido

Resumen

La presente Tesis Doctoral es una contribución al avance de la química del quitosano como una vía de valorización y aprovechamiento de los residuos de cangrejo rojo Procambarus clarkii generados en las Marismas del Guadalquivir. Consta de cinco capítulos bien diferenciados, de los cuales los cuatro primeros tienen como objetivo común el desarrollo de nuevos derivados N-sustituidos de quitosano que por sus propiedades físico-químicas puedan tener aplicación práctica en distintos campos. La unidad activa que a través de una función puente determinada unimos al esqueleto polimérico es responsable o modula esas propiedades, en cada caso. El quinto capítulo explora aplicaciones bio- y tecnológicas concretas, en particular actividad antimicrobiana y capacidad para generar nanopartículas, films y geles, del propio quitosano y de algunos de sus nuevos derivados. En el primer capítulo, titulado "Nuevos derivados anfifílicos de quitosano con funcionalidad de amida y de 1,2-hidroxilamina" se describe la preparación de derivados fluorescentes conteniendo un puente de amida a partir de quitosanos de bajo peso molecular CS4 (Mw = 87875 g·mol-1, DD = 86%) o CS5 (Mw = 97600 g·mol-1, DD = 87%) y distintas cumarinas funcionalizadas (ácido 3-carboxicumarínico, ácido 7-hidroxicumarin-4-il-acético, ácido 7-dietilaminocumarin-3-il-carboxílico). El 7-hidroxicumarinil derivado de quitosano exhibió alta intensidad de emisión de fluorescencia a bajo grado de sustitución (DS 6.7%). Un sensor de cambios de pH, con interesantes propiedades UV y de fluorescencia, con detección exquisita entre pH 1.0 a 7.0, se preparó por reacción de quitosano ácido 7-dietilaminocumarin-3-il-carboxílico. Reacciones modelo entre clorhidrato de 1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-amino-2-desoxi-?-D-glucopiranosa y los ácidos 3-carboxicumarínico y 7-hidroxicumarin-4-il-acético se realizaron previamente para optimizar las condiciones de reacción y facilitar el análisis por espectroscopía de los derivados de quitosano. También se sintetizó un derivado fluorescente quitosano-cumarina con funcionalidad puente de 1,2-hidroxilamina mediante apertura quimioselectiva del anillo de oxirano del (2,3-epoxipropoxi)cumarina por el grupo amino del quitosano y se estudió la regioselectividad del proceso por 2D 1H-1H COSY. El mismo tipo de funcionalidad puente existe en el nuevo derivado de quitosano que se obtuvo mediante apertura nucleofílica del (-)óxido de cariofileno por el grupo amino. Se ha demostrado la capacidad de este derivado y de algunos de los derivados cumarina-quitosano sintetizados para formas micelas en agua y calculado la concentración micelar crítica en cada caso. El DS de los distintos derivados de quitosano preparados se determinó por 1H RMN y osciló entre 6.7 y 42.0 %. Los Mn y Mw de los derivados estudiados mediante HPLC/SEC fueron mayores que los de los quitosanos de partida utilizados, lo que indica que los procesos de preparación empleados transcurren sin degradación de la cadena polimérica. El segundo capítulo bajo el título "Iminas y aminas secundarias derivadas de quitosano" describe, en primer lugar, la preparación de una variedad de los derivados de quitosano del título con propiedades fluorescentes y/o antimicrobianas bajo condiciones muy suaves por reacción, en supensión metanólica acidificada, del quitosano de bajo peso molecular CS5 (Mw 97600 g mol-1, DD = 87%) con aldehídos aromáticos (4-N,N-difenilaminobenzaldehído, bifenil-4-carboxaldehído, 4-nitrobenzaldehído, 4-hidroxibenzaldehído, 4-N,N-dimetilamino-1-naftaldehído, 1-pirencarboxaldehído). Se incluye un estudio sin precedentes para la evaluación del grado de N-sustitución (DS) utilizando 13C CPMAS RMN en las bases de Schiff derivadas de quitosano (DS comprendidos entre el 12.0 y el 31.7%), como es requerido por la conocida inestabilidad de la función imino en soluciones ácidas. Una correlación lineal entre los DS obtenidos para las aminas secundarias derivadas de quitosano mediante 1H RMN (10.2 a 55.3%) y los obtenidos por 13C CPMAS RMN (13.8 a 34.4%) nos ha permitido calcular un factor de correlación empírico que podría ser aplicado en otros sistemas aromáticos basados en quitosano. La reacción simultánea de varios aldehídos con quitosano fue exitosamente llevada a cabo y los resultados de DS de cada una de las unidades incorporadas fueron apoyados/justificados por estudios cinéticos. También se realizó, en colaboración con el Prof. C. Bliard del Institut de Chimie Moléculaire de Reims" CNRS-UMR (Francia), la aminación reductiva del quitosano CS4 con un polisacárido polimaltosídico altamente cristalino, como una forma de obtener una presentación multivalente de un polímero sobre el esqueleto de otro polímero. Algunos de los derivados sintetizados fueron fluorescentes. Los derivados de quitosano nuevos emiten fluorescencia con alta intensidad y estabilidad. Su uso como sensores de polaridad se exploró con la base de Schiff obtenida por reacción del quitosano con el bifenil-4-carboxaldehído, encontrándose que la adición de pequeñas cantidades de disolvente no polar como el diclorometano, provocaba drásticos cambios en la longitud de onda e intensidad de la emisión. Este comportamiento como sensor fluorescente de polaridad, unido a la quiralidad del esqueleto polimérico y a la posibilidad de modular el comportamiento fluorescente variando la naturaleza del aldehído de partida utilizado, permite esperar que estos nuevos polímeros tengan aplicación como sensores polivalentes en sistemas biológicos. Se determinó el Mw y Mn de las aminas secundarias derivadas de quitosano por HPLC/SEC. Los valores de pesos moleculares de los obtenidos para estos derivados respecto a los quitosanos de partida confirmaron que las condiciones de preparación utilizadas no degradan la cadena polimérica. En el tercer capítulo, relativo a "Ureas derivadas de quitosano" se prepararon dos tipos de derivados a partir de quitosano de bajo peso molecular CS4: ureidil derivados por reacción del biopolímero con isocianatos (fenilisocianato, 3,5-dimetilfenilisocianato y 4-bifenililisocianato) y derivados de quitosano entrecruzados a partir de quitosano y diisocianatos [4,4'-metilenbis(fenilisocianato), hexametil diisocianato)]. Previamente, para establecer las condiciones óptimas de reacción se llevaron a cabo las reacciones modelo correspondientes del clorhidrato de 1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-amino-2-desoxi-?-D-glucopiranosa con los mismos isocianatos y diisocianatos. La ausencia de la banda del carbamato a 1700 cm-1 en FTIR, la información proporcionada por 1H RMN, 2D 1H-1H COSY, las condiciones de reacción, y la insolubilidad de los productos en disolventes orgánicos confirman la ausencia de O-sustitución en la reacción entre quitosano y los distintos isocianatos. Los DS de los derivados de quitosano preparados en este capítulo oscilan entre 5.8 y 29.2% (determinados por 1H RMN). El cuarto capítulo, "Formación de derivados de quitosano cuaternizados" describe en primer lugar la cuaternización de los quitosanos de bajo peso molecular CS3 (Mw = 86352 g mol-1, DD = 86%) y CS4 con cloruro de glicidiltrimetilamonio (GTMAC), en condiciones neutras en H2O para el quitosano CS4 y en condiciones ácidas a pH = 3.7 para el quitosano CS3. Estos derivados cuaternizados fueron solubles hasta pH 11 y 12 respectivamente. El estudio de la regioselectividad de la sustitución/apertura nucleófila se realizó con la ayuda de los espectros 1H RMN en tres distintos disolventes deuterados y de los espectros 2D 1H-1H COSY de los productos sintetizados en las distintas condiciones. Se obtuvo primordialmente para ambos tipos de condiciones de reacción el ataque del nucleófilo sobre el carbono menos sustituido del oxirano GTMAC. Con el fin de cuaternizar algunos de los nuestros nuevos derivados N-sustituídos de quitosano se siguieron dos estrategias diferentes. La primera, consistente en la cuaternización del derivado N-sustituido ya obtenido, se ensayó con éxito mediante la reacción de la urea obtenida a partir de quitosano y 3,5-dimetilfenil isocianato, con GTMAC. La segunda, utiliza un quitosano de partida cuaternizado de los descritos en el párrafo anterior, al cual se somete al proceso de N-sustitución deseado. Esta segunda estrategia se ensayó en la aminación reductiva entre el quitosano CS3 cuaternizado en condiciones ácidas y el 4-hidroxibenzaldehído, también con el resultado deseado. La solubilidad en medio ácido diluido de la urea cuaternizada aumentó con respecto a la urea de partida y la amina secundaria cuaternizada fue soluble en medio ácido, H2O y en medio básico hasta pH 12. Los DQ obtenidos para los distintos productos preparados en este capítulo están en el rango de 33.8 a 63.5 %. La realización de filtros de difusión en RMN nos ha permitido demostrar que la base de Schiff resultante de la reacción entre el quitosano CS3 cuaternizado y el 4-hidroxibenzaldehído no es estable en D2O. Dentro del capítulo 5 bajo el título "Aplicaciones" se describe, en primer lugar, la preparación de films a partir de distintas muestras de quitosano de peso molecular bajo y medio: CS1 (Mw = 42400 gmol-1, DD = 87 %), CS3 (Mw = 86352 gmol-1, DD = 86%) y CS6 (Mw = 160253 g mol-1, DD = 83%) por casting en microondas con ciclos de calentamiento y enfriamiento. La formación de films tiene lugar en 40 minutos, procedimiento mucho más rápido que otros métodos de secado descritos (48-72 horas). Además, se prepararon films de derivados de quitosano a partir de los films de quitosano previamente preparados como se ha indicado más arriba, mediante tratamiento de éstos con 4-nitrobenzaldehído, 4-hidroxibenzaldehído o bifenil-4-carboxaldehído. Se han caracterizado los films preparados por análisis de sus propiedades mecánicas y por FTIR. Algunos de los films obtenidos por irradiación con microondas son más resistentes (Módulo de Young = 3360-5129 MPa y TS = 45.5-61.7 MPa) que los hasta ahora descritos en la literatura a partir de quitosano y poseen mayor rigidez (%EB = 2.3-2.8). En un segundo apartado dentro de este capítulo se ha investigado la actividad antimicrobiana de algunos de los biomateriales basados en quitosano que hemos preparado frente a tres tipos de bacterias Gram-negativas: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, y Salmonella typhimurium, obtenidas de la Colección Española de Cultivos Tipos. Los ensayos microbiológicos sobre estas bacterias se realizaron en platos de agar con quitosano o aminas secundarias derivadas de quitosano en solución, films o como sólidos. El quitosano CS1 en disolución presentó alta capacidad de inhibición frente a S. typhimurium y E. coli y la amina secundaria derivada de quitosano resultante de la reacción del biopolímero con bifenil-4-carboxaldehido, en estado sólido presentó actividad antibacteriana sobre los tres tipos de bacterias analizados, mostrando en disolución altos valores del % de inhibición en todos los casos (100, 98.0 y 92.5, para S. typhimurium, E. coli y K. pneumoniae, respectivamente). En tercer lugar en este capítulo, durante una estancia realizada dentro del grupo del Prof. C. Bliard, se ha hecho un estudio comparativo de la preparación de nanopartículas de quitosano por el procedimiento de gelación iónica con tripolifosfato de sodio en 1 % CH3COOH y en tampón 0.1 M NH4OAc /0.2 M CH3COOH obteniéndose mayor cantidad de nanopartículas, con tamaños más homogéneos, y menor tamaño para la misma relación quitosano:TPP al utilizar el tampón 0.1 M NH4OAc /0.2 M CH3COOH, aunque con menor potencial zeta que las preparadas en 1 % CH3COOH. Además, se han preparado nanopartículas del derivado de la reacción entre quitosano CS5 y el ácido 7-hidroxicumarin-4-il-acético y entrecruzando con TPP en tampón 0.1 M NH4OAc /0.2 M CH3COOH. Las nanopartículas de menor tamaño fueron en este caso de 168 nm. Se correlacionó el tamaño de partícula con la emisión de fluorescencia, obteniéndose menor fluorescencia a menor tamaño. Por tanto, este derivado cumarínico origina no sólo micelas en agua, como ya se describió en el capítulo 1, sino también nanopartículas fluorescentes con la posibilidad de calcular el tamaño de las nanopartículas en base a su fluorescencia con una curva de calibración. Finalmente, se ha explorado el proceso de formación de geles híbridas orgánicas e inorgánicas basado en la reacción entre nanopartículas de siloxano y quitosanos de bajo peso molecular (CS1 y CS3). A través de diversos ensayos utilizando diferentes reactivos como nanopartículas preparadas a partir de 3-glicidiloxipropil trimetoxisilano y tetrametoxisilano (nanopartículas GT), nanopartículas preparadas a partir de 3-aminopropil trimetoxisilano y tetrametoxisilano (nanopartículas AT) y glutaraldehído, se han optimizado las condiciones para la formación de geles entre los quitosanos mencionados y partículas GT, lo que nos ha llevado a concluir que el proceso de gelificación en estos casos es claramente dependiente del pH y de la temperatura