Mechanisms underlying gene repression in hypoxia

Resumen

In response to hypoxia, cells activate a stereotyped gene expression pattern that allows them to cope with the restricted oxygen supply. This response involves the induction of hundreds of genes by a mechanism that requires the recruitment of the hypoxia inducible factors (HIFs) to their cis-regulatory regions. On the other hand, the adaptation to reduced oxygen also implies the repression of a large number of genes, but the mechanisms by which hypoxia leads to gene repression have not been uncovered yet. In this thesis work we aimed to identify the general mechanisms that underlie gene downregulation in hypoxia. To this end, we firstly determined the relative contribution of transcription and decay rates to the hypoxic gene expression pattern. Unexpectedly we found that hypoxia leads to a general decrease of RNA stability. In spite of this, our results showed that transcription is the major factor contributing to the gene expression changes triggered by hypoxia, whereas modification of half-lives had marginal impact. Furthermore, although EPAS1 binding was restricted to a fraction of the genes induced by hypoxia, we found that EPAS1 was required for both positive and negative changes of transcription. Taken together, these results suggested that gene repression is indirectly mediated by EPAS1 and consequently we concluded that it should be mediated by transcription factor(s) downstream of EPAS1. With the aim of identifying subsets of genes sharing a common mechanism of regulation, we partitioned genes into different clusters according to their expression pattern over time upon exposure to hypoxia. Next, we exploited the genome-wide transcription factor binding sites generated by the ENCODE project to identify factors enriched in each cluster of co-regulated genes. This analysis revealed a reduced set of transcription factors including, MXI1, BHLHE40 and E2F family members as well as essential components of the co-repressor complex Sin3A as key molecules that could act downstream of EPAS1 to repress gene expression. In summary, our work represents a comprehensive analysis of the mechanisms by which hypoxia downregulates the expression of hundreds of genes. Our results indicate that these changes occur mainly at the transcriptional level and that they are indirectly controlled by EPAS1. We propose that, mechanistically, downregulation of transcription occurs by the recruitment of the Sin3A complex to repressed genes through a reduced set of transcription factors. RESUMEN En respuesta a hipoxia las células activan un patrón de expresión génica característico que permite la supervivencia celular. Esta respuesta incluye la inducción de cientos de genes a través del reclutamiento de los factores de transcripción inducibles por hipoxia (HIF) a sus regiones reguladoras, y también implica la represión de un gran número de genes a través de mecanismos aún no caracterizados. Debido a ello, en este trabajo se ha tratado de identificar cuáles son los mecanismos generales implicados en la represión génica en hipoxia. En primer lugar, hemos determinado la contribución relativa de la tasa de transcripción y de la vida media en el cambio de expresión génica inducido en hipoxia, observando que los cambios en transcripción parecen tener un papel predominante. Sorprendentemente, nuestros resultados también indican que hay una caída general de la estabilidad del ARN en condiciones de hipoxia. Así mismo, hemos determinado que la unión de EPAS1 se limita a las regiones reguladoras de genes inducidos por hipoxia, pero sin embargo, la presencia de EPAS1 es necesaria tanto para la inducción como para la represión génica. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la represión génica en hipoxia está mediada indirectamente a través de EPAS1, es decir, mediante factores de transcripción regulados a su vez por EPAS1. Con el objetivo de identificar subgrupos de genes que compartan un mecanismo de regulación común, se han separado los genes en función de su patrón de expresión génica a lo largo de diferentes tiempos de exposición a hipoxia. Por último, para identificar los factores de transcripción enriquecidos en las regiones reguladoras de cada grupo de genes co-regulados, se han utilizado los sitios de unión de factores de transcripción caracterizados en el proyecto ENCODE. A través de este análisis se han identificado una serie de factores de transcripción, candidatos a participar en la represión génica en hipoxia como por ejemplo MXI1, bHLHE40 o miembros de la familia de factores de transcripción E2Fs, y también componentes fundamentales del complejo co-represor Sin3A. En resumen, en este trabajo se ha realizado un análisis de los mecanismos por los que cientos de genes se reprimen en hipoxia. Nuestros resultados indican que los cambios ocurren mayoritariamente a nivel transcripcional y que están controlados indirectamente a través de EPAS1. El mecanismo que proponemos es que, la unión de determinados factores de transcripción facilita el reclutamiento del complejo co-represor Sin3A a sus genes diana reprimiendo su expresión en hipoxia.