Aplicaciones biotecnológicas del gen "afp" (Antifungical Protein) de "Aspergillus giganteus" para la protección de plantas frente a infección por patógenos

Resumen

Las plantas están constantemente sometidas a estreses ambientales y los hongos son sus principales patógenos. Actualmente, el control de las enfermedades que causan se realiza utilizando compuestos químicos, generando impacto en el medio ambiente. Una alternativa es la obtención de plantas transgénicas resistentes. En un principio, la mayoría de los transgenes provenían de las propias plantas (genes involucrados en las respuestas de densa). Actualmente, y dada su reducida efectividad, se están identificando genes de defensa de otros organismos, como bacterias, insectos, animales y hongos. En este trabajo se ha evaluado la utilidad de la proteína AFP (antifungical protein), producida por el hongo del suelo "Aspergillus giganteus", para actuar como agente antifúngico frente a fitopatógenos de geranio y arroz. Es una proteína con una estructura compacta y muy básica, que se secreta al espacio extracelular. Estudios anteriores ya habían demostrado su actividad antifúngica frente al hongo "Botrytis cinerea", responsable de la enfermedad podredumbre gris en muchas plantas, especialmente las ornamentales. Los resultados revelan una fuerte actividad antifúngica, con inhibición tanto del desarrollo de las hifas como de la germinación de las esporas. Cuando se utiliza en combinación con la proteína cecropina A de lepidóptero, se observa un efecto aditivo entre ambas, lo que puede ser útil para desarrollar estrategias de expresión simultánea de ambos genes en plantas transgénicas. Además, la AFP inhibe el crecimiento de "B. cinerea" tanto "in vitro" como "in vivo", en plantas de geranio. Por otra parte, el hongo "Magnaporthe grises" causa la enfermedad piricularosis en arroz. En este trabajo se ha desarrollado una estrategia para expresar el gen "afp" de manera inducible en plantas transgénicas de arroz con el fin de obtener plantas resistentes y evitar los posibles efectos negativos de una expresión constitutiva, como gasto metabólico y aceptación por los consumidores. Nuestros estudios indicaron que el promotor de un gen PR de maíz, el gen "ZmPR4", es funcional e inducible por el hongo "M. grisea" en plantas de arroz. Este promotor controla la expresión del gen "afp" en niveles suficientes para conferir resistencia a la infección por este hongo en plantas transgénicas. Además este promotor no es activo en el endospermo de la semilla del arroz (órgano destinado al consumo), con lo que se evita que el producto del transgén se acumule en este tejido. Dado el potencial del gen "afp" para aplicación biotecnológica, se hacía necesario determinar su mecanismo de acción, así como sus posibles efectos sobre células animales o vegetales. Para eso, se han realizado diferentes estudios utilizando el hongo "M. grisea". Mediante microscopía electrónica de transmisión y confocal, s eha observado que esta proteína es capaz de formar poros en la membrana del hongo, penetrando en la célula y acumulándose en el núcleo. Además, tiene la propiedad de interaccionar con ácidos nucleicos (DNA o RNA). Estros resultados sugieren que su mecanismo de acción se basa en una combinación de dos actividades: formación de poros en la membrana, e interacción con ácidos nucleicos. Se realizaron también ensayos con células vegetales (protoplastos de arroz) y humanas (células HeLa), que han permitido determinar que la proteína AFP no ejerce efecto nocivo significativo sobre ellas. Los resultados obtenidos permiten concluir que el gen "afp" es un buen candidato para ser utilizado como transgén en la protección de plantas de geranio y de arroz frente a los hongos "Botrytis cinerea" y "Magnaporthe grisea", respectivamente. El promotor del gen "ZmPR4" representa una buena opción para dirigir la expresión de genes antifúngicos en plantas transgénicas de arroz. " SUMMARY: The mold Aspergillus giganteus produces the antifungal (AFP) protein. In this work we have analysed the biotechnological applications of this protein against phythopathogenic fungus (Botrytis cinerea and Magnaporthe grisea). We also studied mechanism of action of AFP against this last fungus. The results are presented in 3 chapters. 1) Botrytis blight caused by Botrytis cinerea is one of the most widely distributed disease of ornamental plants, especially geranium. Here, the antifungal properties of AFP against various B. cinerea isolates were investigated. AFP showed a strong inhibition of mycelial growth and conidial germination by a fungicidal activity. Microscopic observations revealed reduced hyphal elongation and swollen tips. AFP directly protects geranium leaves against Botrytis. These results are discussed in relation to the potential of the afp gene to enhance crop protection against B. cinerea. 2) Rice blast, caused by Magnaporthe grisea, is the most important fungal disease of cultivated rice. We have developed a strategy for creating disease resistance to M. grisea by pathogen-induced expression of the afp gene in transgenic rice plants. Plants expressing the afp gene under the control of the maize ZmPR4 promoter were generated. Transformants showed resistance to M. grisea. Our results suggest that pathogen-inducible expression of the afp gene in rice plants may be a practical way for protection against the blast fungus. 3) The mechanism of action of AFP against Magnaporthe grisea was investigated. AFP was able to produce membrane permeabilization on fungal cells but not on rice or HeLa cells. TEM studies revealed cellular degradation and damage of plasma membranesin AFP-treated fungal cells. AFP was found in the nucleus and gel-retardation experiments confirmed that AFP binds nucleic acids. Together, our results suggest that the combination of fungal cell permeabilization, cell-penetrating ability and nucleic acid-binding activity of AFP determines its antifungal activity. "