Caracterización y análisis funcional de una familia de glutaredoxinas monotiólicas en la levadura

Resumen

Les glutaredoxines són enzims que intervenen en reaccions redox i que la seva funció principal consisteix en protegir les cèl·lules contra estrès oxidatiu mitjançant el manteniment de l'estat redox adequat dels grups sulfidril de les proteïnes cel·lulars. Treballs anteriors han descrit l'existència de dues glutaredoxines en el llevat Saccharomyces cerevisiae, Grx1 i Grx2, que contenen dues cisteïnes en el seu centre actiu les quals són essencials per a mantenir la seva funció. Aquestes dues glutaredoxines juguen diferents papers en la cèl·lula en la protecció contra estrès oxidatiu. Aquest treball consisteix en l'estudi i caracterització d'una nova família de glutaredoxines en S. cerevisiae, formada per Grx3, Grx4 i Grx5, que es diferencia de la ja descrita perquè les proteïnes tenen una única cisteina en el seu centre actiu. S'ha realitzat un anàlisi comparatiu de les seqüències de les dues famílies de glutaredoxines de llevat amb les existents en altres organismes, i s'ha vist que l'estructura bàsica de les mateixes està conservada des de bacteris a humans. L'anàlisi funcional dels mutants d'aquesta nova família ha revelat que, de les tres glutaredoxines monotiòliques, Grx5 és la que desenvolupa una funció més important en la protecció contra estrès oxidatiu, clarament diferenciada de Grx3 i Grx4. Grx5 s'ha vist localitzada en la mitocòndria, essent aquesta localització indispensable per al normal funcionament de l'enzim. Grx3 i Grx4, en canvi, es troben al nucli. D'acord amb la sublocalització cel·lular, es mostren diferents evidències de què Grx5 es troba directament implicada en la biosíntesi dels centres Fe/S, que en llevats té lloc a la mitocòndria. Els mutants mancats de Grx5 són defectuosos en l'activitat d'enzims amb centres Fe/S i acumulen en excés de ferro, tant al citosol com a la mitocòndria. Estudis mitjançant la tècnica del doble-híbrid han demostrat una interacció física entre Grx5 i Isa1, una altra proteïna de la matriu mitocondrial que intervé en la síntesi dels centres Fe/S. Les dades existents indiquen que les glutaredoxines monotiòliques poden portar a terme funcions especialitzades cada una d'elles en diferents compartiments del llevat, sense excloure la possible redundància funcional entre Grx3 i Grx4. RESUMEN Las glutaredoxinas son enzimas que intervienen en reacciones redox y cuya función principal consiste en proteger las células contra estrés oxidativo a través del mantenimiento del estado redox adecuado de los grupos sulfidrilo de las proteínas celulares. Trabajos anteriores han descrito la existencia de dos glutaredoxinas en la levadura Saccharomyces cerevisiae, Grx1 y Grx2, que contienen dos cisteínas en su centro activo las cuales son esenciales para mantener su función. Estas dos glutaredoxinas juegan diferentes papeles en la célula en la protección contra estrés oxidativo. El presente trabajo consiste en el estudio y caracterización de una nueva familia de glutaredoxinas en S. cerevisiae, formada por Grx3, Grx4 y Grx5, que se diferencia de la ya descrita porque las proteínas poseen una única cisteína en su centro activo. Se ha realizado un análisis comparativo de las secuencias de las dos familias de glutaredoxinas de levadura con las existentes en otros organismos, observándose que la estructura básica de las mismas está conservada desde bacterias a humanos. El análisis funcional de los mutantes de esta nueva familia ha revelado que, de las tres glutaredoxinas monotiólicas, Grx5 es la que desarrolla una función más importante en la protección contra estrés oxidativo, claramente diferenciada de Grx3 y Grx4. Grx5 se ha visto localizada en la mitocondria, siendo esta localización indispensable para el normal funcionamiento de la enzima. Grx3 y Grx4, en cambio, se encuentran en el núcleo. En concordancia con la sublocalización celular, se muestran varias evidencias de que Grx5 se halla directamente implicada en la biosíntesis de los centros Fe/S, que en levaduras tiene lugar en la mitocondria. Los mutantes carentes de Grx5 son defectivos en la actividad de enzimas con centros Fe/S y acumulan un exceso de hierro, tanto en el citosol como en la mitocondria. Estudios mediante la técnica del doble-híbrido han demostrado una interacción física entre Grx5 e Isa1, otra proteína de la matriz mitocondrial que interviene en la síntesis de centros Fe/S. Los datos existentes apuntan a que las glutaredoxinas monotiólicas pueden desempeñar funciones especializadas cada una de ellas en compartimentos diversos de la levadura, sin excluir la posible redundancia funcional entre Grx3 y Grx4. SUMMARY Glutaredoxins are enzymes involved in redox reactions, whose main function consists of protecting cells against oxidative stress through maintaining a normal redox status of sulfhydril groups in cellular proteins. Previous work has described two glutaredoxins in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Grx1 and Grx2, that contain two cysteines residues in their active site, which are essential for their enzymatic function. These two glutaredoxins play different roles in protecting cells against oxidative stress. The present work consists of the study and characterisation of a new family of glutaredoxins in S. cerevisiae, composed by Grx3, Grx4 and Grx5. These have a single cysteine in the active site of the protein, in contrast to the previous glutaredoxins. A comparative analysis of the sequences of the two families of the yeast glutaredoxins and the glutaredoxins of other organisms has been carried out, and the basic structure of these enzymes is indeed conserved from bacteria to humans. The functional analysis of mutants of this new family reveals that Grx5 is the most important monothiolic glutaredoxin in protecting cells against oxidative stress, and that its function is different from that of Grx3 and Grx4. Grx5 is located in mitochondria and this localisation is needed for the normal function of the enzyme. In contrast, Grx3 and Grx4 are located at the nucleus. According to the subcellular location, several evidences are shown demonstrating that Grx5 is directly involved in the biosynthesis of Fe/S clusters, which takes place at the mitochondrial matrix in yeast. The grx5 mutants are defective in the activity of Fe/S enzymes and accumulate iron both in mitochondria and cytosol. Twohybrid assays show that there is a physical interaction between Grx5 and Isa1, another matrix mitochondrial protein that participates in the synthesis of Fe/S clusters. All these data suggest that monothiolic glutaredoxins play specialised functions in different compartments of yeast, which does not exclude the possibility that Grx3 and Grx4 could be functionally redundant.