Implicaciones de la variabilidad genética del virus de la hepatitis c genotipo 1 a nivel terapéutico, evolutivo y epidemiológico

Resumen

Desde su identificación en el año 1989, el virus de la hepatitis C (VHC) sigue siendo un grave problema de Salud Pública. Se estima que actualmente existen unos 130 millones de personas en el mundo con hepatitis C crónica y que cada año tienen lugar entre 3 y 4 millones de nuevas infecciones. Dado que la hepatitis C crónica es progresiva por naturaleza, la infección por el VHC es el factor desencadenante de aproximadamente el 30% de casos de cirrosis y carcinoma hepatocelular en el mundo, además de ser la causa principal de trasplante hepático en los países desarrollados. Cabe destacar que, hoy por hoy, no existe una vacuna profiláctica efectiva para luchar contra la infección por el VHC. El VHC es un virus con genoma RNA que posee una elevada tasa de replicación y de mutación. Por ello, el VHC presenta un alto grado de variabilidad genética y en un paciente infectado circula en forma de cuasiespecies. Esta distribución en cuasiespecies representa una ventaja adaptativa para el virus ya que le permite evolucionar rápidamente adaptándose al entorno y, por lo tanto, tiene numerosas implicaciones biológicas; entre ellas, el establecimiento de una infección persistente por selección de mutantes de escape a los anticuerpos neutralizantes y linfocitos T, cambios en la patogenicidad del virus y progresión de la enfermedad hepática, además de la selección de mutantes resistentes a los nuevos fármacos específicos contra el virus. Al mismo tiempo, el grado de variabilidad genética en determinadas regiones del genoma del VHC, como son las regiones codificadoras de las glicoproteínas de la envuelta E1 y E2, y las proteínas NS5A y Core, se ha relacionado con la probabilidad de alcanzar una respuesta virológica sostenida (RVS) a la terapia con interferón (IFN)-a. En esta Tesis nos hemos propuesto estudiar la variabilidad genética del VHC y sus implicaciones en el fracaso terapéutico y en la epidemiología molecular del virus. El tratamiento actual de la hepatitis C crónica se basa en la administración combinada de IFN-¿ pegilado (pegIFN-¿) y ribavirina, dos fármacos que no han sido diseñados específicamente para el VHC sino que actúan principalmente reforzando la respuesta inmune del hospedador. Dada la naturaleza de estos fármacos, no es posible saber si un paciente concreto responderá o no a la terapia en base a la presencia de determinadas mutaciones de resistencia en el genoma vírico como ocurriría con otras infecciones tratadas con inhibidores de las enzimas víricas. En el caso del VHC, los mecanismos que llevan al fracaso terapéutico no se conocen en detalle pero incluyen factores tanto del propio virus como del hospedador, así como del tratamiento. Si bien se espera que los fármacos específicos frente a la proteasa y la polimerasa del VHC salgan al mercado durante los próximos años, es muy probable que éstos tengan que administrarse junto con el pegIFN-¿ y la ribavirina debido a la rápida aparición y selección de mutantes resistentes. Por otro lado, el tratamiento actual frente a la hepatitis C crónica con pegIFN-¿ y ribavirina representa un elevado coste para la Sanidad Pública. A este hecho hay que sumarle que con esta terapia se consigue una baja tasa de RVS, especialmente en los pacientes infectados por el genotipo 1, y que presenta efectos secundarios molestos y potencialmente graves en la mayoría de los pacientes tratados. Todo ello, crea la necesidad de predecir las probabilidades de éxito antes de iniciar la terapia, tanto para reducir los costes asociados al tratamiento como para mejorar la calidad de vida de los pacientes. Hoy en día, la terapia no puede ser individualizada en base a ninguno de los predictores basales de respuesta descritos hasta el momento. En este sentido, en esta Tesis nos hemos propuesto identificar factores basales, tanto clínicos como virológicos, asociados con la respuesta a la terapia combinada mediante la comparación de pacientes con RVS y no respondedores, con la finalidad de desarrollar y evaluar la utilidad de modelos estadísticos multivariantes que nos permitan predecir el fallo terapéutico antes de iniciar el tratamiento antivírico. Este estudio se ha focalizado en pacientes infectados por el subtipo 1b (VHC-1b), dado que es el más prevalente en España y se ha asociado con un mayor riesgo de desarrollar carcinoma hepatocelular. Principalmente, como factores virológicos nos hemos centrado en la variabilidad genética a nivel de cuasiespecies presente en la región E1-E2 y en la composición de aminoácidos (aa) de la región core. Las secuencias correspondientes a la región E1-E2 se han obtenido mediante clonaje y secuenciación debido a su elevado nivel de variabilidad genética, mientras que las correspondientes a la región core, al ser más conservada, se han obtenido mediante secuenciación directa. Los factores basales más significativamente asociados con el fallo terapéutico en nuestra población de estudio fueron niveles menores de alanina transaminasa (ALT), un mayor número de haplotipos (es decir, un mayor número de variantes víricas circulantes en suero diferentes entre ellas) en la región E1-E2 y la ausencia de los aa arginina en la posición 70 y leucina en la 91 de la región core. Así mismo, la respuesta a la terapia combinada no vino dada por un origen evolutivo común del VHC-1b en nuestra población de pacientes, ni pareció estar relacionada con la conservación de aa determinados en las glicoproteínas E1-E2 o en la proteína Core. Por otro lado, sí se observó una mayor heterogeneidad genética basal de las poblaciones víricas correspondientes a la región E1-E2 en los pacientes no respondedores, la cual podría estar involucrada en el fallo terapéutico ya sea a través de la pre-existencia o la generación de variantes víricas resistentes. Ya que ninguna de las variables anteriores permitió predecir la respuesta con fiabilidad individualmente, nos propusimos desarrollar modelos estadísticos multivariantes que incluyeran las variables más relevantes, tanto clínicas como virológicas, y que nos permitieran predecir el fallo terapéutico de manera más precisa. Para obtener estos modelos de predicción se utilizaron análisis estadísticos multivariantes, especialmente de tipo discriminante. La fiabilidad de los modelos se evaluó internamente aplicando el método de validación cruzada leave-one-out. Los resultados obtenidos demuestran que el uso de modelos estadísticos discriminantes que combinen factores clínicos y virológicos podría ser de utilidad en la predicción de la respuesta a la terapia combinada en pacientes infectados por el subtipo 1b. Mientras que el modelo discriminante 1 predijo con más exactitud el fallo terapéutico en nuestra población de estudio (especificidad del 100%), la validación cruzada indicó que el modelo discriminante 2 era más reproducible. La aplicación de este segundo modelo en una población independiente similar a nuestra población de estudio en términos de etnicidad, características clínicas y subtipo del VHC podría evitar la terapia en un 63,6-81,8% de los pacientes no respondedores, mientras que la mayoría de pacientes con posibilidades de responder serían identificados y tratados (sensibilidad, 85,7-95,2%). En base a la bibliografía existente hasta el momento, este es el primer estudio que describe un modelo discriminante para predecir el fallo terapéutico antes de iniciar la terapia. Si las predicciones obtenidas con el modelo discriminante 2 se confirmaran en una población independiente de pacientes, la información obtenida podría ayudar a los facultativos a restringir la terapia a aquellos pacientes con posibilidades de responder, reduciéndose significativamente los costes totales de la misma. En aquellos pacientes sin posibilidades de responder, se podría evitar la terapia y los efectos secundarios asociados, a la espera de un régimen terapéutico más efectivo. Continuando con la misma línea de trabajo del estudio anterior, nos propusimos determinar el efecto de la terapia sobre la dinámica evolutiva de las poblaciones víricas de la región E1-E2 en pacientes no respondedores e infectados por el subtipo 1b, para así profundizar en el conocimiento sobre el fracaso terapéutico. Para poder estimar este efecto era necesario comparar estos pacientes con controles no tratados y monitorizados durante el mismo periodo de tiempo; son pocos los estudios que incluyen controles debido a la dificultad de obtención de muestras seriadas en pacientes no tratados. Los resultados obtenidos demuestran que si bien las características virológicas basales (carga vírica y grado de variabilidad genética de la región E1-E2) fueron similares entre pacientes no respondedores nulos y no respondedores con recidiva infectados por el VHC-1b, éstos podrían mostrar diferentes patrones evolutivos durante el tratamiento. Los pacientes no respondedores nulos presentaron diferentes patrones de evolución durante la terapia, dependiendo de la susceptibilidad inicial de las poblaciones víricas a la terapia antivírica y a la adaptación a la respuesta inmune, y estos patrones no se pudieron diferenciar de aquellos observados en los controles no tratados, donde el VHC evoluciona por efecto de la presión ejercida por el sistema inmune. En cambio, en los pacientes no respondedores con recidiva, después de la drástica reducción de la carga vírica en suero ocasionada por la terapia, se observó una población vírica genéticamente más homogénea que en el pretratamiento, derivada a partir de aquellas variantes que habían logrado sobrevivir a la terapia. Si bien no pudimos evidenciar que el tratamiento antivírico conllevara la selección de aa concretos en los pacientes no respondedores, nuestros resultados muestran que en presencia de tratamiento, la variabilidad genética de las poblaciones víricas correspondientes a la región E1-E2 tiende a disminuir. Esta disminución fue mucho más pronunciada en los no respondedores con recidiva que en los no respondedores nulos, mientras que no se observaron cambios significativos en los controles no tratados. El hecho de que las poblaciones víricas observadas en el momento del fallo terapéutico sean más homogéneas que antes de iniciar la terapia, podría estar reflejando la adaptación del virus a la presión ejercida por la terapia antivírica, con la supervivencia de las variantes víricas mejor adaptadas al entorno. Los análisis de variabilidad genética a nivel de cuasiespecies implican la utilización de técnicas complejas, laboriosas y costosas de biología molecular, además de los posteriores análisis bioinformáticos y filogenéticos. Por esta razón existe una limitación en el número de pacientes incluidos en los dos trabajos anteriores. No obstante, los resultados obtenidos contribuirán a entender los factores involucrados en el fracaso terapéutico y a mejorar el manejo de los pacientes con hepatitis C crónica infectados por el subtipo 1b del VHC. Por otro lado, esta Tesis también ha contribuido a caracterizar la variabilidad genética del VHC genotipo 1 con la obtención del primer genoma completo del subtipo 1g (VHC-1g), ampliando el conocimiento sobre la epidemiología molecular del virus. Las vías de transmisión más posibles del subtipo 1g en nuestra paciente de estudio fueron la transfusión sanguínea u otras prácticas médicas invasivas, de manera similar a las observadas mayoritariamente para el subtipo 1b. La determinación del subtipo del VHC no tiene un impacto clínico en cuanto a la terapia actual. Sin embargo, en estudios epidemiológicos (estudios de brotes y de vías de transmisión) y de evolución del virus es necesario conocer el subtipo del VHC. Además, en el contexto de los nuevos fármacos en desarrollo inhibidores de la proteasa y de la polimerasa del VHC, determinar el subtipo será probablemente de gran importancia ya que los subtipos 1a y 1b pueden presentar patrones de resistencia diferentes y, por lo tanto, podrían darse fenómenos similares en el resto de subtipos del genotipo 1 del VHC. Según el documento de consenso, para la designación confirmada de un nuevo subtipo se requiere al menos una secuencia genómica completa. Se debe demostrar que ésta agrupa separadamente del resto de subtipos del mismo genotipo mediante análisis filogenéticos rigurosos, confirmar la ausencia de recombinación y establecer el grado de divergencia genética con el resto de subtipos del mismo genotipo a lo largo del genoma completo. Con la primera secuencia genómica completa de un aislado correspondiente al VHC-1g se ha podido demostrar que éste agrupa separadamente del resto de subtipos del mismo genotipo, y no se han hallado evidencias de recombinación con otros subtipos ni otros genotipos. Cabe mencionar que, según nuestros resultados, la divergencia evolutiva del subtipo 1g tuvo lugar anteriormente a la de los subtipos 1a, 1b y 1c del genotipo 1. Finalmente, con los datos aportados por el presente estudio, el subtipo 1g cumple con los requisitos del documento de consenso para pasar de estado provisional a confirmado.