Una nueva subfamilia de peptidasas m14 relacionadas con la tubulina. Implicaciones funcionales, estructurales y evolutivas

Resum

Las metalocarboxipeptidasas constituyen la familia M14 de peptidasas, que está dividida en tres subfamilias: M14A, M14B y M14C. Estas peptidasas están ampliamente distribuidas en los organismos vivos y se encuentran relacionadas con numerosos procesos de procesamiento o maduración proteica que requieren un estricto control y una alta especificidad. A la Familia M14 pertenecen también otras peptidasas aún sin clasificar como la tubulina carboxipeptidasa, que hidroliza el carboxilo terminal de la alfa-tubulina, y la peptidasa Nna1 de ratón, que se sobreexpresa en los proceso de regeneración de axones. Las peptidasas homólogas a Nna1 son unas peptidasas recién descubiertas, cuya localización, estructura y función están aún por dilucidar. La tubulina carboxipeptidasa, en cambio, está moderadamente estudiada a nivel bioquímico, se conoce su función celular y su localización, pero no se conoce su secuencia ni se ha podido purificar en estado funcional. A partir de estos dos conceptos nos planteamos la hipótesis de que las peptidasas tipo Nna1 pudieran actuar como tubulina carboxipeptidasas. En el presente trabajo hemos ampliado el conocimiento acerca de las peptidasas homólogas a la Nna1 de ratón. Demostramos que constituyen una nueva subfamilia dentro de la Familia M14. Definimos las arquitecturas de dominios y los motivos de unión al zinc que las caracterizan y construimos un modelo tridimensional que muestra la conservación de la topología y la arquitectura del centro activo de las peptidasas M14. Describimos la localización intracelular de las peptidasas tipo Nna1 humanas y demostramos que estas proteínas forman parte de estructuras microtubulares que sufren destirosinación, como los centriolos y los microtúbulos del huso mitótico. Además, identificamos la AGBL2/CCP2 y la AGBL4/CCP6 en la fracción de proteínas asociadas a citoesqueleto de las células HeLa, fracción activa como tubulina carboxipeptidasa. Por otro lado, analizamos la distribución taxonómica de las peptidasas tipo Nna1 y demostramos que existe una estrecha correlación con la presencia de cilios y centriolos y con la conservación del ciclo de destirosinación/retirosinación de la tubulina. Todos estas evidencias apoyan la tesis de que las peptidasas tipo Nna1 actúan como tubulina carboxipeptidasa. Por otra parte, utilizamos el parásito Plasmodium falciparum para realizar ensayos de inhibición de metalocarboxipeptidasas en el ambiente celular. Demostramos que el Inhibidor de Carboxipeptidasa de Patata (PCI) provoca la inhibición del crecimiento del parásito a través de la inhibición de la tubulina carboxipeptidasa y que la expresión de la peptidasa tipo Nna1 del parásito (PfNna1) se regula positivamente en presencia del inhibidor. Además, diseñamos una variante del PCI con la cola carboxilo cambiada por el carboxilo terminal de la tubulina del parásito. Esta variante de PCI resulta ser más potente y específica frente a la peptidasa PfNna1 del parásito que el inhibidor salvaje. Estos resultados vinculan directamente las peptidasas tipo Nna1 con la actividad tubulina carboxipeptidasa y establecen la posibilidad de que la PfNna1 de P. falciparum sea una nueva diana antimalárica. Apoyados en estudios filogenéticos, proponemos que los genes tipo nna1 estuvieron presentes en el último ancestro común eucariota y planteamos varias hipótesis con respecto a las funciones de las proteínas que codifican, todas relacionadas con el citoesqueleto de microtúbulos. Por último, proponemos que las peptidasas tipo Nna1 sean nombradas carboxipeptidasas citosólicas o CCPs.