Mecanismes d'alliberació d'ATP a travès de la membrana plasmàticapaper de la CD39 i les connexines.

Resumen

LATP és una molècula molt carregada elèctricament important per a lobtenció de lenergia necessària per lactivitat cellular. A més a més, també actua com a molècula de senyalització cellular. Normalment, la secreció controlada dATP té lloc a través de lexocitosi de grànuls o vesícules. Tot i això, en algunes cèllules, altres mecanismes poden controlar lalliberació dATP. En aquesta tesi shan estudiat dos daquests mecanismes: lalliberació dATP a través de la proteïna CD39 i lalliberació dATP a través de connexines. La CD39, o NTPDasa 1, és una proteïna que hidrolitza nucleòtids trifosfat i difosfat fins a nucleòtids monofosfat. Resultats anteriors del nostre laboratori suggerien que, aplicant polsos hiperpolaritzants en la membrana dels oòcits de Xenopus, lectoenzim NTPDasa1 podia esdevenir permeable per lATP. Continuant amb lestudi daquesta proteïna, es va voler determinar també si estava relacionada amb lalliberació dATP induïda per estrès hipertònic descrita en oòcits. Per portar a terme aquests estudis, era necessari aconseguir un oligonucleòtid antisentit contra la CD39 dels oòcits de Xenopus. Per tant, el nostre primer objectiu va ser sintetitzar i validar aquest oligonucleòtid, per tal de poder-lo utilitzar posteriorment a lhora de fer els experiments. Mitjançant el disseny de dos oligonucleòtids antisentit per dita proteïna es va mesurar lalliberació dATP en grups doòcits injectats amb els oligonucleòtids i en grups control, després de ser sotmesos a un xoc hiperosmòtic. Al mateix temps, per a comprovar lefectivitat dels oligonucleòtids injectats, es va mesurar lactivitat ATPàsica en aquests oòcits. Es va observar com lantisentit per la CD39 reduïa de manera significativa lalliberació dATP i el corrent iònic després de 13 minuts dexposició hipertònica. Els hemicanals, formats per connexines, és un altre dels possibles mecanismes de regulació de lalliberació dATP. En les gap junctions, les connexines uneixen el citoplasma de dues cèllules adjacents establint un canal intercellular que permet el pas dions i molècules més petites d1 KDa. Es va estudiar aquest mecanisme en oòcits de Xenopus, estudiant la Cx38, un tipus específic de connexina endògena dels oòcits, i la Cx32, expressada en els oòcits de manera heteròloga. En els experiments amb la Cx38, vam observar que solucions lliures dions divalents activaven un corrent dentrada en els oòcits que era inhibit per octanol i àcid flufenàmic, dos inhibidors de les gap junctions. Aquest corrent sensible a calci, depenia de lexpressió de Cx38: disminuïa en oòcits injectats amb un oligonucleòtid antisentit per la Cx38 (ASCx38) i augmentava en oòcits que sobrexpressaven la Cx38. A més, lactivació dels hemicanals de Cx38 induïa lalliberació dATP, la qual era inhibida per làcid flufenàmic, loctanol i lASCx38 i augmentada en la sobrexpressió de Cx38. Aquests resultats suggerien que lactivació dels hemicanals era responsable de lalliberació dATP en els oòcits de Xenopus. Daltra banda, vam investigar lalliberació dATP a través dels hemicanals formats per Cx32 expressada en oòcits. Aquesta proteïna sexpressa en la majoria dòrgans humans, però, particularment, mutacions de la Cx32 en les cèllules de Schwann produeixen la malaltia de Charcot-Marie-Tooth lligada al cromosoma X (CMTX). En oòcits que expressen la Cx32, vam combinar lús de tècniques de fixació de voltatge per registrar els corrents iònics generats pels hemicanals i la reacció bioluminiscent de la luciferina-luciferasa per mesurar lalliberació dATP. Els hemicanals formats per la Cx32 eren estimulats mitjançant polsos despolaritzants generant un corrent iònic de sortida. Després de lestimulació, en el període de repolarització, hi havia un corrent de cua que coincidia amb el moment dalliberació dATP. Làrea daquest corrent tenia una relació lineal amb la quantitat dATP alliberada. El conjunt de resultats daquesta tesi ens suggereixen que, tant les connexines com la CD39, participen en lalliberació dATP a través de la membrana plasmàtica. " SUMMARY: ATP is an electrically charged molecule required to obtain the energy necessary for cellular activity; in addition, it is an intercellular signaling molecule. Usually, the controlled secretion of ATP occurs through the exocytosis of granules and vesicles. However, in some cells, other mechanisms control ATP release. Two of these mechanisms have been studied in this thesis: ATP release through CD39 and ATP release through connexin hemichannels. CD39, or NTPDasa 1, is a protein that hydrolyze nucleotide triphosphates and nucleotide diphosphates to nucleotide monophosfates. To study its relationship with ATP release we have synthetized an antisense oligonucleotide against Xenopus oocyte CD39. Our results indicate that the antisense against CD39 significanty reduce ATP release and also the ionic current due to the activation of CD39 by hypertonic solution. It has been suggested that hemichannels, formed by connexins, may be an alternative pathway for ATP release. In gap junctions, connexins link the cytoplasm of two adjacent cells by establishing an intercellular channel. We have investigated the release of ATP from Xenopus oocytes through hemichannels formed by connexin 38 (Cx38), an endogenous, specific type of connexin, and by connexin32 (Cx32) heterologously expressed in Xenopus oocytes. In Xenopus oocytes, calcium-free solution reversibly activates an inward current that is inhibited by octanol and flufenamic acid. This calcium-sensitive current depends on Cx38 expression: its decreased in oocytes injected with an antisense oligonucleotide against Cx38 (ASCx38) and is increased in oocytes overexpressing Cx38. Moreover, the activation of Cx38 also induce the release of ATP, which is inhibited by flufenamic acid, octanol and ASCx38 and increased by Cx38 overexpression. Connexin 32 is expressed in most of human organs but, particularly, Cx32 mutations present in Schwann cells produce X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. In oocytes expressing Cx32, application of depolarizing pulses to positive potentials induce outward hemichannel currents that become inward during the repolarization phase. The release of ATP occurred during the repolarization period and the amount of ATP released correlate with the area of the tail current. "