Análisis del silenciamiento génico en infecciones virales en plantasproteínas virales supresoras en un sistema silenciado

Résumé

En los últimos años se ha descrito un fenómeno de regulación de la expresión génica en eucariotas genéricamente conocido como silenciamiento por RNA o ribosilenciamiento, basado en la degradación específica de secuencias de RNA codificante, bloqueando de este modo la funcionalidad del gen correspondiente. Las funciones biológicas que el silenciamiento desempeña comprenden la regulación de procesos de desarrollo y diferenciación celular, así como la constitución de un sistema de defensa frente a parásitos moleculares extra e intracelulares. En este sentido, los virus han evolucionado codificando proteínas capaces de suprimir el silenciamiento génico, actuando sobre diferentes etapas del proceso. En la presente Tesis fue obtenido un sistema transgénico silenciado (Nicotiana benthamiana) que presenta resistencia completa frente al virus donante (CMV-Fny) de la secuencia viral (fragmento truncado de 2a) contenida en el transgén. A partir de ahí, fue demostrada la responsabilidad que el silenciamiento del transgén tenía sobre la imposibilidad de infección de dichas plantas por el virus donante. Con la expresión transitoria (agroinfiltración) de tres proteínas virales supresoras (HC-Pro, 2b y E3L), una de ellas codificada por el virus vacunal de mamíferos, fue bloqueado localmente el silenciamiento del transgén, permitiendo así la infección del virus donante en esas hojas infiltradas. Esta supresión del silenciamiento del transgén y la correspondiente infección local de la hoja infiltrada con el supresor, no bastó para permitir a CMV-Fny desarrollar una infección sistémica, denotando, entre otras causas, el mantenimiento del silenciamiento del transgén (y la producción de siRNAs derivados) a nivel floemático no afectado por la expresión de los supresores agroinfiltrados. Como una vía alternativa de expresión heteróloga de supresores por medio de CMV, fue diseñado un RNA quimérico (RNAX), del que fue demostrada su capacidad de ser replicado y traducido durante la infección con su virus vector CMV, pero del que no pudo ser constatado el movimiento a larga distancia con el resto de RNAs genómicos virales. Mediante la técnica de agroinfiltración conjunta de GFP y un putativo supresor, fue posible correlacionar la carencia de efecto sinérgico con la incapacidad de suprimir el silenciamiento en un mutante puntual de HC-Pro y, por otra parte, fue determinada por primera vez la potente capacidad supresora de la proteína E3L del virus vacunal en plantas. Así fue probado que proteínas supresoras en animales tienen funcionalidad en plantas, argumentando en favor de la conservación de rutas metabólicas sensibles para la ingeniería replicativa viral.