Desarrollo de cepas de interés biotecnológico mediante la manipulación genética de los genes recA y slpA de Thermus thermophilus

Resumen

En este trabajo se han obtenido estirpes mutantes mediante la inserción en el gen recA de Thermus thermophilus del cassette de resistencia a kanamicina, así como mediante la deleción de la secuencia comprendida entre las dos dianas BglII del gen recA. La obtención se llevó a cabo aplicando por primera vez en Thermus un sistema de selección negativa con dideoxinucleótidos. El análisis de dichos mutantes reveló que la inactivación del gen recA conlleva un elevado descenso de la viabilidad en T.thermophilus, que se acentúa según se suceden las rondas de cultivo y que la inactivación del gen recA y la subsiguiente pérdida de viabilidad se ven acompañadas de un incremento muy grande de la tasa de mutación expontánea a medida que se suceden las rondas de crecimiento. Este incremento detectado tanto sobre marcadores endógenos (cambios del fenotipo) como sobre indicadores exógenos (genes reporteros), es dependiente de la temperatura de incubación y parece ser el que motiva la pérdida total de viabilidad al cabo de varios reinóculos como consecuencia de la acumulación expontánea de daños sobre el DNA. De la misma manera, la competencia natural de la especie se mantiene en la estirpe mutante recA, lo que indica que RecA no es requerido para la transformación. Si bien el material transformado en el mutante no sufre reorganizaciones, indicando una disminución apreciable de la tasa de recombinación. También se han obtenido estirpes mutantes mediante la inserción en el gen slpA de Thermus thermophilus del cassette de resistencia a kanamicina, así como mediante la deleción del cassette y de la secuencia sustituida por éste, utilizando por primera vez en Thermus un sistema de selección negativa con ampicilina. El estudio de ambos mutantes ha revelado que la región líder 5'UTR del mRNA de slpA actúa estabilizando la vida media del mensajero, viéndose compensada su pérdida por un incremento en el nivel de trasnc