Clonación, secuenciación y expresión de la fosfofructokinasa de "Dictyostelium discoideum"producción del enzima en levadura

Resumen

Se han aislado y secuenciado dos fragmentos de cdna y uno de dna genomico solapantes que, reunidos, codifican la secuencia aminoacidica completa de la fosfofrutokinasa (pfk) de dictyostelium discoideum, una proteina de 804 aminoacidos con una masa molecular de 92,4 kda. La secuencia de cdna incluye una region 3' no codificante de 63 pb que incluye dos señales de poliadenililacion y una cola de poli (a). Se ha aislado tambien una region de 1650 pb cadena arriba del codon atg iniciador en la que se ha identificado una posible caja tata y varios sitios de inicio de la transcripcion la proteina deducida presenta maxima homologia con las de otras pfks y contiene dos sitios de fosforilacion para la protein-kinasa dependiente de camp, en consonancia con su fosforilacion in vitro por esta kinasa. La alineacion con otras secuencias de pfks reguladoras ha puesto de manifiesto que gran parte de los residuos asignados a sitios ligantes estan conservados en esta enzima, aunque se han localizado cambios estructurales que pueden relacionarse con su falta de mecanismos de control alosterico. Esta comparacion ha permitido ademas construir un arbol filogenetico para la familia de las pfks. Hemos encontrado tambien que esta pfk esta codificada por un solo gen, cuya expresion disminuye gradualmente a lo largo del desarrollo. Se ha sobreexpresado el enzima en una cepa de saccharomyces cerevisiae deficiente en pfk, mostrando caracteristicas similares a las de la proteina salvaje y sin que se afecte el crecimiento de los transformadores en glucosa.