Análisis de la topología del DNA durante la replicación

Resum

La topología del DNA cambia constantemente a medida que progresa la replicación. Pero la dinámica de este proceso es hasta hoy desconocida. Para abordar este problema en Escherichia coli, construimos varios plásmidos con un origen ColE1 y una barrera polar para la replicación localizada a distintas distancias del origen. El análisis de los intermediarios de replicación de estos plásmidos por electroforesis bidimensional en geles de agarosa y microscopia electrónica nos ha permitido comprobar que el superenrollado negativo disminuye a medida que avanza la horquilla. Hemos comprobado que la cloroquina y el bromuro de etidio, que inducen el superenrollamiento positivo de moléculas no replicadas, son incapaces de inducir en superenrollamiento positivo de los intermediarios de replicación. Esto se debe a que en los intermediarios el superenrollamiento positivo es inmediatamente adsorbido por una regresión de las horquillas. El anudamiento de las doble-hélices hermanas dentrás de la horquilla ocurre normalmente durante la replicación. Para estudiar la dinámica de la formación de nudos, utilizamos geles bidimensionales para identificar burbujas anudadas en moléculas con la horquilla detenida en distintos sitios a lo largo del proceso. Hemos comprabado que el número y complejidad de burbujas anudadas aumenta en función del tamaño de la burbuja, lo que sugiere que la probabilidad de anudamiento es inversamente proporcional a la densidad de pre-encadenados. Finalmente, estudiamos las consecuencias topológicas de la colisión frontal entre replicación y trascripción. Los resultados obtenidos indican que este tipo de colisión favorece la formación de burbujas anudadas y que un exceso de intermediarios anudados tendría consecuencias deletéreas para la segregación. Esta podría ser al menos una de las razones por lo que a lo largo de la evolución los genomas han evitado la colisión frontal entre transcripción y re