Construcción y caracterización de mutantes condicionales de la H+-ATPasa de membrana plasmática de levadura

Resumen

En esta tesis se aborda el estudio funcional y extructural de la h -atpasa de membrana plasmatica de levadura a traves de dos enfoques experimentales distintos. En su primera parte se demuestra que la expresion de este enzima es necesaria para el crecimiento de las levaduras a traves de la construccion de un gen hibrido que coloca la expresion de este gen bajo el control de un promotor dependiente de galactosa. Las levaduras portadoras de este gen crecen en medios con galactosa, en los que se expresa el enzima y no crecen en medio con glucosa, en los que el enzima no se expresa. En la segunda parte se obtienen y analizan una serie de mutantes termosensibles para este enzima. Los mutantes se obtuvieron por mutagenesis quimica del gen aislado, reintroduciendo posteriormente el gen mutado en levaduras cuyo gen de la h -atpasa esta bajo el control de promotores dependientes de galactosa. Las mutaciones fueron localizadas mediante la construccion de genes quimericos entre el gen normal y los genes mutados y posteriormente secuenciadas. En todos los casos estudiados las mutaciones termosensibles suponen cambios de aminoacidos en regiones conservadas entre los genes de las distintas atpasa de tipo (e-p) conocidas. Uno de los mutantes termosensibles presenta, ademas, una variacion en las propiedades de activacion por glucosa del enzima, de forma que se comporta como si estuviera en un estado permanentemente activado. Las enzimas purificadas a partir de los mutantes termosensibles presentan una mayor inestabilidad termica que el enzima no mutado.