Aislamiento y caracterización en fructosa-6-P,2-kinasa/fructosa-2,6-P2asa de "Dictyostelium discoideum"

Resumen

Se han purificado y caracterizado desde el punto de vista cinetico y regulador las actividades responsables de la sintesis y degradacion de fructosa-2,6-p2, fructosa-6-p,2-kinasa y fructosa-2,6-p2asa en dictyostelium discoideum. Estas actividades copurifican tras cromatografia sobre cm-sephadex, blue-sepharose y superose 6b, lo que sugiere que coexistan sobre la misma proteina, tratandose entonces de un enzima bifuncional, para el que hemos determinado un peso molecular de 140kda. La actividad fructosa-6-p,2-kinasa muestra un ph optimo de 6,0 y tiene unos valores de km para el fructosa-6-p y el mgatp de 0,14 y 0,4 mm, respectivamente. Se estimula por fosfato y se inhibe fuertemente por fosfoenolpiruvato. La actividad fructosa-2,6-p asa tiene un ph optimo de 6,5, un valor de km de 3 um y es inhibida por fructosa-6-p; no respondiendo estas actividades a otros efectores descritos en otros tipos celulares. Estas caracteristicas muestran que la fructosa-6-p,2-kinasa/fructosa-2,6-p2asa de d. Disciudeum corresponde a un isozima diferente a los identificados hasta ahora en otras celulas. Se han encontrado dos formas para este enzima bifuncional, claramente separables por cromatografia de intercambio ionico, que poseen peso molecular y propiedades cineticas semejantes, estableciendose la mayor diferencia entre ellos a nivel de las caracteristicas reguladoras de la actividad fructosa-6-p, 2-kinasa. Estas dos posibles formas isoenzimaticas estas presentes igualmente durante el desarrollo de este organismo y se han encontrado tambien en levadura sin que en este caso se hayan detectado diferencias significativas entre ellas. Las actividades fructosa-6-p,2-kinasa y fructosa-2,6-p2asa no se modifican por tratamiento con proteina kinasa dependiente de camp y los niveles de fructosa -2,6-p2 no varian en presencia de pma, lo que sugiere que el mecanismo fundamental para la regulacion de la concentracion intracelular de fructosa-2, 6-p2 en d