Estudios bioquímicos, biofísicos y celulares de la estructura del tallo ribosómico de Saccharomyces cerevisiae

Resumen

Se realizó un estudio del tallo ribosómico de levadura, que contempló una caracterización bioquímica, obteniéndose proteínas ácidas mutagenizadas que se analizaron mediante entrecruzamiento químico de los ribosomas portadores de estas proteínas mutagenizadas. Se encontró formación de dímeros y unión a ribosoma de estos dímeros en todos los casos ensayados con las proteínas del tipo P2, pero en el caso de las proteínas del tipo P1, éstas se unen a ribosomas sólo cuando existen dos sitios de unión para estas proteínas libres en el ribosoma. Un estudio biofísico posterior, consistió en la expresión y purificación de distintas proteínas P del tallo ribosómico y la posterior medición de las constantes de asociación entre ellas, usando la técnica de resonancia de plasmones de superficie. Se regristró un valor de Kd= 2,2 x 10-7, entre la proteína recombiante P2beta y un fragmento correspondiente a los últimos 98 aminoácidos de la proteína P0. El estudio celular se realizó mediante una técnica muy novedosa de microscopía de dos fotones asociada a espectroscopía correlacional de fluorescencia. Se obtuvieron proteínas P de fusión a GFP y se expresaron en distintas cepas de levadura. La cepa W303 presentó una autofluorescencia muy alta que impedía la medición de intensidad de fluorescencia debida a la presencia de la proteína de fusión a GFP. Se cambió de fondo genético de estudio a una cepa Dpep4, deficiente en proteasas vacuolares. En este fondo genético se comprobó que cuando se expresan dos proteínas de fusión a GFP,la intensidad de fluorescencia es el doble que cuando se expresa sólo una. Topdos estos experimentos en conjunto apoyarían la teoría de una composición homogéna de tallos ribosómicos, donde existirían una proteína ácida de cada tipo unida al ribosoma.