Digestión gastrointestinal de proteínas alimentarias y biodisponibilidad de péptidos resistentes a la digestión

Resumen

En esta Tesis Doctoral se han realizado estudios relacionados con la digestión gastrointestinal de proteínas lácteas. Por un lado, se han llevado a cabo experimentos centrados en conocer la degradación de las proteínas lácteas e identificación de los productos de digestión, tanto a nivel gástrico como intestinal, en modelos in vivo porcinos y en humanos, mediante técnicas de proteómica y peptidómica basadas en espectrometría de masas en tándem. Por otro lado, estos datos han servido para validar un modelo de digestión gastrointestinal in vitro consensuado internacionalmente. Además, se ha estudiado el efecto en los productos de digestión al incorporar un extracto de proteasas de la membrana intestinal del borde en cepillo en el protocolo de digestión. Finalmente, se ha evaluado la capacidad de transporte que tienen ciertos péptidos generados en estas digestiones y que además tienen interés fisiológico tanto de proteínas lácteas, como de un péptido bioactivo derivado de soja. Inicialmente, se estudió el comportamiento de la caseína al ser sometida a la fase gástrica de la digestión, obteniéndose muestras en duodeno de cerdos canulados que fueron alimentados con una suspensión de caseína micelar. Por otro lado, se realizaron digestiones gástricas in vitro con este mismo sustrato. Ambas digestiones fueron analizadas mediante espectrometría de masas en tándem, en donde se identificaron más de 4000 péptidos en el caso de los digeridos in vivo. Se identificaron los péptidos que se generan tras la digestión gástrica y se comprobó que sólo un 1% del contenido en nitrógeno correspondió a aminoácidos libres. Además, la formación de péptidos y aminoácidos resultó ser muy similar entre las digestiones in vivo e in vitro, lo que permite concluir que el protocolo de la fase gástrica de la digestión supone una buena aproximación a la digestión gástrica para las caseínas lácteas. El estudio de la fase intestinal de la digestión se realizó en muestras de aspirados a nivel de yeyuno de voluntarios humanos que habían consumido caseínas y proteínas. de suero lácteo, que fueron cedidas por el grupo INRA UMR0914 Nutrition Physiology and Ingestive Behavior de AgroParisTech (Francia). Se identificaron más de 200 péptidos en el caso de las proteínas séricas y más de 400 en el caso de las caseínas. No se detectó caseína intacta, pero sí β-lactoglobulina en los primeros tiempos de la digestión. También se observó una disminución del número de péptidos encontrados conforme los tiempos de la digestión crecían, sugiriendo una degradación de los mismos a péptidos de menor tamaño o aminoácidos libres, mientras que las regiones resistentes, aparentemente, coincidieron con zonas ricas en prolina y en aminoácidos cargados negativamente. La degradación proteica y la generación peptídica en la digestión in vitro mediante el protocolo consensuado ofreció unos resultados de nuevo similares a lo que se observó in vivo, confirmando que el método supone una buena aproximación fisiológica a la digestión gastrointestinal de las proteínas lácteas. Posteriormente, se quiso analizar si la incorporación de peptidasas del borde en cepillo como paso adicional al protocolo consensuado de la digestión in vitro podría suponer una mejora a la hora de simular la digestión gastrointestinal in vivo. Los resultados mostraron una mayor generación de péptidos por la acción de amino- y carboxi-peptidasas, de los cuales, muchos de ellos coincidían con péptidos identificados en los digeridos yeyunales. Aunque la incorporación de este extracto no supone una mejora sustancial en el método consensuado de digestión gastrointestinal in vitro, puede ser importante a la hora de estudiar la resistencia de determinados péptidos y su posible funcionalidad y absorción intestinal. A continuación, se estudió la capacidad de transporte transepitelial de un grupo de péptidos procedentes de la β-caseína que habían mostrado su resistencia a las digestiones estudiadas, incluso con la adición de las peptidasas del borde en cepillo. Los péptidos f(59-68) VYPFPGPIPN, f(63-68) PGPIPN y f(59-67) VYPFPGPI, mostraron una mayor capacidad de transporte a través de monocapas de células Caco-2 que los péptidos f(60-66) YPFPGPI, f(62-66) FPGPI y f(60-62) YPF, ligada muy posiblemente a la naturaleza hidrofóbica de los residuos Val and Pro en posición N-terminal. Asimismo, se analizó la resistencia a la digestión gastrointestinal y la capacidad de transporte de ciertos péptidos procedentes del péptido lunasina de soja obteniéndose varias regiones resistentes a la digestión e identificándose la ruta paracelular como principal ruta de transporte para el péptido RKQLQGVN. Además, se estudió la actividad citotóxica de varios fragmentos de la lunasina en diferentes cultivos celulares, observándose que, tanto la lunasina completa como el f(1-10) SKWQHQQDSC, tenían una alta actividad citotóxica, aunque esta actividad dependía del cultivo celular empleado, siendo más susceptibles las células AGS y HT-29 que las Caco-2.