Genetic and molecular analysis of the virulence plasmid of Salmonella enterica serovar Typhimurium

Resum

Salmonella enterica serovar Typhimurium posee un plásmido de gran tamaño (93 Kb) llamado plásmido de virulencia o pSLT. Dicho plásmido contiene el locus spv, esencial para la infección sistémica en roedores. El plásmido fue presumiblemente adquirido por el hospedador ancestral de Salmonella mediante conjugación. En la mayoría de las estirpes del serovar Typhimurium, el plásmido pSLT contiene un operón tra completo. En esta tesis se han realizado diversos análisis estructurales y funcionales en el plásmido pSLT, habitualmente empleando estrategias genéticas (sobre todo, uso de mutantes). En condiciones de laboratorio, la adición de desoxicolato sódico a los cultivos permite la detección de aislados curados del plásmido. Ello sugiere que la estabilidad de PSLT puede hallarse comprometida en vivo, ya que las sales biliares alcanzan concentrationes notables en el intestino delgado y especialmente en el duodeno. La síntesis de los pili conjugativos codificados por pSLT no causa sensibilidad a bilis, a diferencia de lo que ocurre con los pili codificados por el plásmido F. Es posible que el paso de Salmonella por el tracto hepatobiliar a lo largo de millones de años haya seleccionado variantes del plásmido de virulencia resistentes a bilis. La frecuencia de curación de pSLT en presencia de desoxicolato sódico aumenta en un mutante carente del módulo de adicción CcdAB. Ello sugiere que dicho módulo es funcional en Salmonella. La posibilidad de que el plásmido de virulencia sufra curación en el duodeno plantea la posibilidad de que la conjugación tenga un alto valor selectivo durante la infección de animales. Dado que las células curadas del plásmido de virulencia tienen menor capacidad de infección sistémica, recuperar el plásmido pSLT en el propio intestino podría tener valor adaptativo. La transferencia del plásmido de virulencia durante la infección del ratón se detecta con relativa facilidad, ya que las frecuencias de conjugación son sorprendentemente altas. Sustancias típicas del duodeno (bilis) y del intestino grueso (propionato) inhiben la frecuencia de transmisión conjugativa de pSLT. Perece probable que la conjugación dentro del ratón tenga lugar en el íleon. Esta hipótesis es apoyada por la detección de transconjugantes a alta frecuencia en asas de íleon de ratón. Un factor clave en la regulación de la transferencia conjugativa de pSLT es la actividad del sistema FinOP de inhibición de la fertilidad. Un ensayo de análisis transcriptómico mostró que el ARN FinP tenía dianas en el cromosoma. Una de ellas es el gen biosintético cysD. En presencia de RNA FinP, la cantidad de transcrito cysDNC aumenta. También se observa un aumento a nivel de proteína. La deleción del gen cysD aumenta la frecuencia de conjugación un orden de magnitud, proporcionando un indicio de que la biosíntesis de cisteína afecta a la conjugación. Ya que la proteína CysD está implicada en la ruta biosintética de la cisteína a partir de sulfato, se estudió si el fenotipo conjugativo de la deleción era debido a una segunda función de CysD o a su implicación en la biosíntesis de L-cisteína. La interrupción de la ruta en otro paso indicó que la biosíntesis de cisteína estaba implicada en la transferencia del plásmido. Además, los productos finales de la ruta (sulfuro y cisteína) producen una disminución en la frecuencia de conjugación. Por tanto, FinP inhibe la transferencia del plásmido de virulencia a través de dos vías: i) como ARN antisentido de traJ; e ii) aumentando los niveles de L-cisteína a través de dianas cromosómicas en trans, y específicamente aumentando la expresión del operón cysDNC. Finalmente, se ha estudiado la posible adaptación de los plásmidos de virulencia a su hospedador. Para ello se calcularon las frecuencias de conjugación de tres estirpes diferentes: LT2, ATCC 14028 y SL1344. Cada estirpe mostró tener una frecuencia específica de conjugación, que dependía únicamente del propio plásmido. En la estirpe SL1344 la frecuencia de conjugación era más baja, y la causa principal parece hallarse en una mutación en el gen traG. Sin embargo, los tres plásmidos son totalmente intercambiables para la virulencia. Estos resultados, junto con la abundancia de deleciones en los operones tra de otros serotipos (y en menor medida en aislados naturales del serovar Typhimurium) sugieren que los genes spv están sometidos a selección, mientras que los genes tra son más o menos neutros. Si esta interpretación es correcta, parece plausible que los plásmidos de virulencia de Salmonella evolucionen hacia formas no autotransmisibles.