Oligosacáridos de la leche materna, un reto para las leche de fórmulaingeniería de proteínas de la enzima lacto-N-tetraosa de bifidobacterium bifidum para la síntesis de lacto-n-tetraosa

Resumen

Actualmente se tienen evidencias de los numerosos beneficios que los oligosacáridos de la leche materna (human milk oligosaccarides, HMOs) confieren a los recién nacidos, ya sea a nivel local o sistémico. La leche humana se considera única debido a la concentración, calidad y complejidad de sus HMOs. Es conocido que estas moléculas ejercen diversas funciones biológicas actuando como prebióticos, inmuno- moduladores, inhibidores de patógenos, entre otras. Hasta la fecha se han identificado más de 200 estructuras de HMOs diferentes, siendo imposible su obtención a partir de fuentes naturales. Debido a su elevada complejidad estructural la síntesis química a gran escala de estos carbohidratos sigue siendo un reto, requiriendo de numerosas etapas sintéticas. Por esto motivo, las leches de formula contienen principalmente HMOs de estructuras simples como 2’FL, DFL y 3’/6’-SL. La síntesis enzimática es una interesante alternativa sintética para la producción de estas moléculas, ya que, gracias a las enzimas, permite controlar la estero- y regioselectividad del oligosacárido formado. La leche humana presenta como HMO mayoritario el tetrasacárido lacto-N-tetraosa (LNT) y sus derivados fucosilados y/o sialilados. La enzima lacto-N-biosidasa de B.bifidum es la responsable de hidrolizar el tetrasacárido LNT en el metabolismo del recién nacido alimentado con leche materna. Con el objetivo de producir el compuesto LNT, en esta tesis se ha llevado a cabo el rediseño de la enzima lacto-N-biosidasa de B.bifidum (LnbB) con el fin de obtener un biocatalizador eficiente para la producción de este tetrasacárido. Para ello, se han aplicado diferentes estrategias: i) rediseño racional basado en el estudio estructural de los subsitios negativos de la enzima LnbB, ii) rediseño de los subsitios positivos de LnbB a partir de herramientas computacionales y iii) síntesis secuencial del compuesto LNT. La enzima LnbB pertenece a la familia GH20 y cataliza la hidrólisis de la molécula de LNT, dando lugar a los disacáridos lactosa y lacto-N-biosa. En esta tesis se han rediseñado los subsitios de la enzima LnbB empleando métodos de ingeniería de proteínas, para testar así su síntesis mediante la estrategia de transglicosidación por control cinético empleando dadores de glicosilo activados. Concretamente para el rediseño racional de los subsitios negativos de la enzima se han realizado estudios de conservación y estructurales, seleccionando y modificando aquellos aminoácidos involucrados en la unión y estabilización de la molécula dadora. Por otro lado, dado que la enzima no presenta subsitios definidos de unión al aceptor, para el rediseño de los subsitios positivos se ha empleado el software BINDSCAN desarrollado en el Laboratorio de Bioquímica de IQS. En esta tesis también se ha explorado la síntesis secuencial del compuesto LNT empleando la estrategia glicosintasa, combinando las enzimas β-galactosidasa Bacillus circullas (Bgac) E233G y LnbB (D320E_W394F).