Dendrímeros antigénicos fijados sobre nanopartículas para diagnostico in vitro de alergia a fármacos

Resum

Las Reacciones Adversas a Fármacos (RAF) constituyen actualmente un problema sanitario importante debido al gran desconocimiento sobre los mecanismos por los que se desencadenan, lo que se traduce en una ausencia de pruebas diagnósticas suficientemente sensibles y específicas para su diagnóstico. Este problema se ha manifestado en numerosos foros científicos, existiendo un acuerdo unánime entre todas las partes interesadas en este problema (academia, industria, asociaciones de pacientes) para el desarrollo de iniciativas encaminadas a resolver dichas limitaciones. Actualmente nos enfrentamos a dos grandes problemas a la hora de abordar el estudio de los aspectos relacionados con la respuesta inmune (los procesos de reacción adversa a antígenos hapténicos -proceso alérgico- y en particular a fármacos): i) menor sensibilidad de los métodos diagnósticos in vivo e in vitro que obliga a identificar las nuevas estructuras hapténicas que inducen las reacciones, y ii) una retirada de los kits comerciales habiendo dejado un vacío que debe ser solucionado. El grupo de investigación en el que se ha realizado este trabajo de tesis doctoral, ha desarrollado una investigación focalizada en dos objetivos básicos: i) disponer de una herramienta que nos permita estudiar el proceso de reconocimiento molecular antígeno-anticuerpo responsable de las reacciones alérgicas a fármacos; ii) desarrollar test in vitro para la detección de las reacciones alérgicas a fármacos. En base a todos los resultados prometedores obtenidos a lo largo de la trayectoria de investigación del grupo, en esta tesis se ha desarrollado una nueva línea de investigación. Esta se sustenta en el estudio de la síntesis de partículas de sílice como soporte sólido para los nano-conjugados desarrollados previamente dendrímero-hapteno, en los test in vitro utilizados actualmente para el diagnóstico de reacciones adversas a fármacos. Uno de los test in vitro utilizados actualmente para el diagnóstico de alergias a fármacos (en particular antibióticos betalactámicos) es el RAST (Radio Alergo Sorvent Test). En este tipo de ensayo, el suero del paciente se pone en contacto con un soporte sólido (discos de celulosa) donde se ha anclado en su superficie un homopolipeptido PLL (Poli-L-Lisina), al cual se conjuga el fármaco que se pretende estudiar. Nuestro grupo ha estado trabajando en dos sentidos para mejorar este test en los últimos años. La primera modificación realizada implicó la sustitución del péptido por un dendrímero (macromolécula que emula a esta proteína). En este sentido, se ha desarrollado una metodología eficaz y reproducible para la síntesis de estos conjugados, aumentando la densidad de fármaco que se une a la superficie sólida, dando excelentes resultados de sensibilidad y selectividad. La segunda modificación, ha consistido en la sustitución de la fase sólida por un (nano)material compatible, como zeolitas y (nano)partículas de sílice. En estos trabajos se obtuvieron resultados prometedores en el diagnóstico in vitro de pacientes alérgicos a amoxicilina. Otro de los test empleados en la detección de alergia a fármacos es el Test de Activación de Basófilos (BAT). En este sentido, el grupo también ha demostrado la utilidad de los dendrímeros en este tipo de prueba diagnóstica. En este proyecto de tesis, se ha llevado a cabo las síntesis de nuevos (nano)materiales híbridos que combinan la alta superficie funcional de las nanopartículas de tamaño conocido con el uso de estructuras multivalentes bien definidas como son los dendrímeros, con el objetivo de seguir con el desarrollo de métodos in vitro de detección de IgEs en pacientes alérgicos a fármacos (antibióticos betalactámicos). Los resultados obtenidos se han aplicado a test tipo RAST (Radio Alergo Sorben Test) y BAT (Basofil Activation Test). Basándonos en estos estudios y en colaboración con el grupo de enfermedades alérgicas a fármacos y alergenos del Hospital Regional de Málaga - IBIMA, FIMABIS Y BIONAND liderado por la Doctora M.J. Torres, con el que el grupo de investigación tiene una larga y estrecha trayectoria de colaboraciones, se han sintetizado en este trabajo partículas de sílice con el fin de preparar nuevos nanomateriales que contengan estos determinantes antigénicos tan prometedores para desarrollar test in vitro para el diagnóstico de pacientes alérgicos a este tipo de fármacos. 1. Síntesis de Partículas de Sílice de diferentes tamaños. La síntesis de partículas de sílice se ha llevado a cabo utilizando el método de Stöber, uno de los métodos Sol-Gel más citados en la obtención de coloides, cuyo precursor es un tetraalcóxido de silicio. La importancia de obtener nanopartículas con diferentes tamaños reside en que la capacidad de funcionalización de las nanopartículas es dependiente del tamaño, siendo mayor la funcionalización cuanto menor tamaño tenga la partícula (mayor área superficial por gramo de partículas). Esto permitiría aumentar en gran medida la concentración de conjugado hapteno-portador disminuyendo la cantidad de nano-material empleado en cada ensayo. Sin embargo, para la realización hospitalaria de la prueba RAST, es necesario la recuperación del soporte sólido tras los procesos de lavado. En este caso, se realiza por un proceso de centrifugación. Este proceso es más lento a menor tamaño de nano-conjugado, por lo que se pueden incrementar los tiempos de realización del test, llegando a ser inviables para su uso clínico. Por ello, hay que llegar a un compromiso donde la partícula sea lo suficientemente grande para que el tiempo de centrifugación sea rápido y lo suficientemente pequeña para tener la mayor área superficial posible. De esta manera, se emplea menor cantidad de partículas y suero para obtener una detección eficaz. Manteniendo el compromiso citado anteriormente, en este trabajo hemos sintetizado partículas de 500 y 200 nm decoradas con DeAn para mejorar el diagnóstico mediante RAST, ampliando además el estudio a otros fármacos (como bencilpenicilina).Por otro lado, es importante citar las limitaciones que presentan los ensayos RAST, como la dependencia de un isótopo radiactivo, instalaciones específicas y personal capacitado. Para evitar la realización de ensayos que implican trabajar con radioactividad, se propone otra prueba de diagnóstico de alergia a medicamentos in vitro como es el test de activación de basófilos (BAT). Esta pretende imitar la activación celular in vivo mediada por IgE y liberación del mediador, siendo esta prueba útil para evaluar reacciones mediadas por IgE para una variedad de fármacos inyectables, ya que no es necesario utilizar conjugados fármaco-portador. Sin embargo, su sensibilidad depende del fármaco involucrado. Esta técnica, se basa en la determinación de marcadores de activación expresados en la superficie de los basófilos después de la interacción del fármaco con sIgE. Sin embargo, la falta de conocimiento de los mecanismos de activación ha obstaculizado una aplicación clínica más amplia. Los fármacos betalactámicos no son capaces de activar basófilos por sí mismos. Para ello se requiere su conjugación con una molécula portadora, que generalmente se encuentra presente en la sangre. El conjugado generado ha de ser lo suficientemente grande como para permitir la reticulación de dos sIgE unidas a la superficie del basófilo. Sin embargo, se dispone de muy poca información sobre el tamaño y la composición de estos conjugados. El uso de conjugados bien definidos de hapteno-portador sería una herramienta valiosa para la investigación del mecanismo a través del cual ocurre la activación. De aquí, que en este trabajo de investigación se hayan sintetizado nanopartículas de diferentes tamaños (20 y 50 nm) decoradas con DeAn para estudiar la activación del basófilo La modificación de la superficie de las partículas se ha llevado a cabo mediante el siguiente procedimiento Una primera reacción con aminopropiltrietoxisilano (APTES), para introducir grupos amino en la superficie de la partícula. Estos grupos se hacen reaccionar posteriormente con anhidrido succínico, para introducir grupos ácidos carboxílicos en la superficie de la partícula. Estos grupos se hacen reaccionar con el dendrímero PAMAM de segunda generación. Una vez anclado covalentemente el dendrímero a la partícula, se realiza el último paso de modificación del dendrímero con el fármaco a estudiar. En este trabajo, los fármacos que hemos comenzado a estudiar son amoxicilina bencilpenicilina y ambos unidos al mismo dendrímero La monitorización del proceso de modificación superficial de las partículas se ha llevado a cabo empleando diferentes técnicas, como la cuantificación del número de grupos aminos primarios libres presente en la superficie de las partículas, mediante Test de ninhidrina, TEM, DLS y Z-Potencial. Las técnicas como TEM y DLS nos han dado información sobre la homogeneidad y el tamaño de la muestra, mientras que las medidas de Z-potencial y FTIR nos han permitido conocer en valores cualitativos el tipo de grupo funcional que hay en la superficie de la nanopartícula. Además, han realizado estudios de por RMN de sólidos para comprobar la correcta funcionalización del fármaco en la superficie de la partícula. Los resultados obtenidos de todas las técnicas de caracterización son reproducibles y coherentes con la síntesis y funcionalización propuesta. Todos los tamaños de partículas sintetizados y funcionalizados en su superficie con determinantes antigénicos han sido probados mediante ensayos RAST en el laboratorio del grupo de enfermedades alérgicas a fármacos y alergenos del Hospital Regional de Málaga - IBIMA, FIMABIS Y BIONAND liderado por la Doctora M.J. Torres 2. Síntesis de Partículas con núcleo magnético recubiertas de una capa de Sílice. El desarrollo de RAST con partículas de sílice consta de dos etapas de incubación, entre las cuales hay que llevar a cabo procesos de lavado. La recuperación de la fase sólida por centrifugación. Esto genera un problema a la hora de optimizar los tiempos del test ya que a menor tamaño de partícula tenemos mayor área superficial, es decir una mayor funcionalización, pero a su vez aumentamos los tiempos de centrifugación por lo que se aumenta directamente el tiempo de realización de dicho test. Este hecho nos lleva a tener que adoptar un compromiso entre tamaño de partícula y tiempo de centrifugación como hemos expuesto en los anteriores puntos. Para solucionar este problema, hemos desarrollado en este trabajo de tesis una alternativa como son las partículas de núcleo magnético (Fe3O4) recubiertas de una capa de sílice. Este tipo de partículas permiten la misma funcionalización en su superficie que las partículas de sílice debido a su recubrimiento con sílice, permitiendo eliminar las etapas de centrifugación, ya que los lavados constan de la imantación de las partículas para separarlas del sobrenadante, pudiendo así utilizar partículas de tamaños menores y por consecuencia ganando área superficial y disminuyendo el tiempo de realización del test. Los tamaños sintetizados para el estudio de este tipo de materiales mediante inmunoensayo ensayo RAST han sido 15, 30, 50 y 200nm. La reacción de formación de la partícula de hierro se ha llevado a cabo haciendo reaccionar una mezcla en cantidades estequiométricas de FeCl3·6H2O, etilenglicol, NaOAc (seco) y polietilenglicol. Una vez formada la partícula, se ha hecho reaccionar EtOH absoluto, NH3 concentrado, H2O y Tetraetilortosíliceto para formar una capa de sílice alrededor de la partícula de hierro. Una vez en este punto, la modificación de la superficie de las partículas se ha llevado a cabo de manera análoga al método descrito en el apartado anterior. Al igual que en el caso anterior, la caracterización de estas partículas modificadas en su superficie se lleva a cabo mediante Test de ninhidrina, TEM y Z-Potencial. La técnica como TEM nos da valores sobre la homogeneidad y el tamaño de la muestra, mientras que el Test de ninhidrina y el Z-potencial nos da valores tanto cualitativos como cuantitativos sobre los grupos funcionales que están anclados la superficie de la nanopartícula. Además de estudios mediante XPS, hemos podido comprobar la correcta funcionalización del fármaco en la superficie. Todos los resultados obtenidos de las diferentes técnicas de caracterización han resultado ser muy reproducibles y coherentes con la síntesis propuesta. Todos los tamaños de partículas sintetizados y funcionalizados en su superficie con determinantes antigénicos han sido probados mediante ensayos RAST en el laboratorio del grupo de enfermedades alérgicas a fármacos y alergenos del Hospital Regional de Málaga - IBIMA, FIMABIS Y BIONAND liderado por la Doctora M.J. Torres