Aplicación de ultrasonidos en la identificación de las estructuras cerebrales y la monitorización de la hemorragia intracerebral en rata

Resumen

INTRODUCCIÓN La hemorragia intracerebral (HIC) se produce como consecuencia de la rotura de un vaso sanguíneo arterial o venoso, que conlleva a una extravasación de sangre dentro de la cavidad craneal. Aunque este representa entre el 10-15 % de todos los ictus, su mortalidad y morbilidad es mayor que la del infarto cerebral. La patogenia de la HIC consiste en una lesión primaria causada por la formación del hematoma, y una lesión secundaria causada por la reacción inflamatoria generada. El pronóstico de la misma depende de la gravedad del sangrado que condiciona el deterioro neurológico, por lo que un diagnóstico precoz es clave para favorecer la recuperación. En la actualidad, las técnicas disponibles para el diagnóstico del ictus son la tomografía computarizada (TC) o la resonancia magnética (RM). Sin embargo, estas cuentan con una serie de limitaciones como son la disponibilidad, el tiempo de adquisición, la necesidad de transportar al paciente, la tolerabilidad o la radiación ionizante en el caso de la TC. Por ello, incorporar nuevas herramientas que solventen los mencionados inconvenientes, supondría un avance en el diagnóstico precoz y seguimiento. En este sentido, los ultrasonidos son una técnica rápida, no invasiva, bien tolerada, económica y portátil, que permite obtener imágenes dinámicas, proporcionando información estructural y funcional de interés. Diversos estudios han demostrado la validez de los ultrasonidos en la monitorización de la HIC en pacientes, sin embargo, estos trabajos no han sido lo suficientemente relevantes como para conseguir su implementación en la práctica clínica habitual. Es por ello, que surge la necesidad de llevar a cabo estudios de investigación en modelos preclínicos para poder trasladar la utilidad de los ultrasonidos a los pacientes. En lo que respecta a los modelos animales, la RM es la técnica de referencia para estudiar el cerebro in vivo, debido a su alta resolución y sensibilidad. No obstante, debido a sus limitaciones, se deberían buscar alternativas a la misma y es ahí donde los ultrasonidos, al haber experimentado un gran avance tecnológico en cuanto a la calidad y definición de las imágenes, podrían tener una gran relevancia en el estudio y la monitorización de la HIC, evaluando el parénquima cerebral y los cambios estructurales que se producen como consecuencia de la lesión. Por todo ello, debido a los rápidos avances de las tecnologías de imagen, es necesario llevar a cabo más investigaciones preclínicas que reforzarían la evidencia científica en este campo, permitiendo la traslación al paciente. HIPÓTESIS En base a estos antecedentes nos planteamos la siguiente hipótesis: El uso de los ultrasonidos permitiría la identificación de las estructuras cerebrales en roedores. Además, en un modelo animal experimental de hemorragia intracerebral los ultrasonidos permitirían la evaluación y su monitorización, estudiando los cambios evolutivos en el volumen de la misma, así como las alteraciones estructurales que se producen como consecuencia del daño generado. OBJETIVOS Para demostrar la hipótesis planteada nos proponemos los siguientes objetivos: 1. Establecer la utilidad de los ultrasonidos en la visualización e identificación de las estructuras cerebrales en rata. 2. Evaluar en un modelo animal de hemorragia intracerebral la utilidad de los ultrasonidos en el estudio de la lesión cerebral (volumen de hemorragia y desplazamiento de estructuras cerebrales) comparando los datos obtenidos con la resonancia magnética. 3. Valorar la utilidad de los ultrasonidos en la monitorización de los cambios evolutivos en el volumen de la hemorragia intracerebral y en el desplazamiento de las estructuras cerebrales. 4. Analizar la correlación del volumen de la hemorragia intracerebral, medido por ultrasonidos y por resonancia magnética, con la evaluación funcional. MATERIALES Y MÉTODOS Objetivo 1. Se utilizaron un total de 6 ratas sanas machos y hembras (3 machos y 3 hembras) Sprague-Dawley (225-275 g). El análisis de la anatomía cerebral se realizó mediante estudios por RM de 7 Teslas (T) para obtener imágenes en T2. Se utilizó un ecógrafo Xario 200 G con una sonda lineal de 13 MHz para la obtención de imágenes en modo B. Con el fin de reducir los obstáculos para la visualización de estructuras mediante ultrasonidos, se realizaron 4 abordajes transcraneales: el transductor se colocó directamente sobre la piel, el cráneo, una craneotomía delimitada y una craneotomía total. Los animales se sacrificaron al finalizar la visualización de estructuras. Para identificar y correlacionar las estructuras cerebrales ex vivo se creó un atlas y se llevó a cabo la tinción de Nissl. Objetivos 2, 3 y 4. Se utilizaron un total de 31 ratas machos y hembras (16 machos y 15 hembras) Sprague-Dawley (225-275 g). Los animales se dividieron en 3 grupos: 1, sanos (n=10, 5 machos y 5 hembras); 2, sham (n=10, 5 machos y 5 hembras); 3, HIC (n=11, 6 machos y 5 hembras). La inducción de la HIC se realizó mediante la inyección de 0,5 U de colagenasa-IV en los ganglios basales del hemisferio derecho siguiendo las referencias estereotáxicas 0,04 mm posterior, 3,5 mm lateral y 6 mm ventral respecto al área de Bregma. Los animales sham fueron sometidos a todo el procedimiento quirúrgico a excepción de la administración de colagenasa-IV. La evaluación neurológica para analizar el déficit motor de los animales, se realizó mediante el test de la barra, la barra con escalón, el cilindro rotatorio (Rotarod) y el test de Rogers: antes de la inducción de la HIC y a las 48 horas, 96 horas y 1 mes tras la cirugía. La obtención de imágenes cerebrales en T2 se llevó a cabo mediante RM de 7 T a las 48 horas y al mes de la cirugía. Los estudios por ultrasonidos se realizaron antes de la cirugía y a las 5 horas, 48 horas, 96 horas y 1 mes de la cirugía. El volumen de HIC (AxBxC/2) y el desplazamiento de estructuras cerebrales (distancia cisternas subaracnoideas-duramadre) se analizó tanto por ultrasonidos como por RM, comparándose los datos entre ambas técnicas. Los animales se sacrificaron al mes tras la inducción de la HIC. La normalidad de los datos fue comprobada con el test Shapiro-Wilk. Para contrastar la existencia de diferencias significativas en las variables entre los grupos, se usó el test de Tukey si no se rechazaba la normalidad de los datos, o de Mann-Whitney si se rechazaba su normalidad. Para comparar la similitud entre los datos se usaron los coeficientes de correlación de Pearson y Spearman. Los p-valores menores a 0,05 fueron considerados significativos. RESULTADOS Objetivo 1: Establecer la utilidad de los ultrasonidos en la visualización e identificación de las estructuras cerebrales en rata. A través del atlas anatómico, la RM y los cortes histológicos teñidos con Nissl, se identificaron las siguientes estructuras cerebrales: corteza cerebral, cuerpo calloso, ventrículos laterales, tercer ventrículo, estriado, cisternas subaracnoideas y acueducto cerebral. Por ultrasonidos, a medida que se avanzaba en los diferentes abordajes transcraneales (piel, cráneo, craneotomía delimitada y craneotomía total) para la visualización de las estructuras cerebrales, estas fueron más claramente identificadas. Así, a través de la piel solo se pudieron identificar las cisternas subaracnoideas. Cuando el transductor se colocó sobre el cráneo, así como sobre la craneotomía delimitada, se pudieron identificar más estructuras como los ventrículos laterales y las cisternas subaracnoideas. Finalmente, con la craneotomía total fue posible visualizar un mayor número de estructuras que correspondían a los ventrículos laterales, tercer ventrículo, acueducto cerebral y cisternas subaracnoideas. Objetivo 2: Evaluar en un modelo animal de hemorragia intracerebral la utilidad de los ultrasonidos en el estudio de la lesión cerebral (volumen de hemorragia y desplazamiento de estructuras cerebrales) comparando los datos obtenidos con la resonancia magnética. En el modelo experimental de HIC se observó la hemorragia por ultrasonidos como una señal hiperecogénica a las 48 horas, volviéndose hipoecogénica al mes. Al analizar por la técnica de ultrasonidos el volumen de la HIC, este disminuyó significativamente desde las 48 horas (66,22 ± 23,19 mm3) al mes (17,36 ± 9,97 mm3, p=0,001). La RM identificó la lesión como una señal hiperintensa a las 48 horas, transformándose al mes en heterogénea. Al analizar por RM el volumen de la HIC, también se observó una reducción en el mismo entre las 48 horas y el mes (71,86 ± 24,75 mm3 vs. 21,49 ± 9,74 mm3, p=0,001). Al comparar los resultados entre ambas técnicas de imagen, se observó una excelente correlación en la medición del volumen de HIC tanto a las 48 horas (r=0,905, p=0,001) como al mes (r=0,656, p=0,028). En cuanto al desplazamiento de las estructuras cerebrales causado por el efecto de masa de la HIC, se identificó por ultrasonidos una mayor distancia en la ratio de las cisternas subaracnoideas con respecto a la duramadre en el lado ipsilateral a la lesión en el grupo de animales con HIC (1,06 ± 0,04) comparado con el grupo de animales sanos (0,99 ± 0,02, p=0,001) y el grupo sham (0,99 ± 0,04, p=0,004) a las 48 horas. Por RM, también se observó en el hemisferio ipsilateral una mayor distancia de las cisternas-duramadre en el grupo de animales con HIC (1,06 ± 0,04) con respecto al grupo sano (0,98 ± 0,02, p=0,002) y sham (0,99 ± 0,03, p=0,008) a las 48 horas. Sin embargo, estas diferencias desaparecieron al mes con ambas herramientas de imagen (p > 0,05). Al cotejar estos datos entre ambas técnicas, se observó una buena correlación en la medición de la distancia de las cisternas-duramadre en el hemisferio contralateral (r=0,906, p=0,001) e ipsilateral (r=0,870, p=0,001) al mes. Objetivo 3: Valorar la utilidad de los ultrasonidos en la monitorización de los cambios evolutivos en el volumen de la hemorragia intracerebral y en el desplazamiento de las estructuras cerebrales. Por ultrasonidos se observó como la HIC disminuía significativamente con el tiempo, desde las 5 horas (58,92 ± 24,70 mm3), 48 horas (66,22 ± 23,19 mm3) y 96 horas (65,27 ± 27,62 mm3) con respecto al mes (17,36 ± 9,97 mm3, p=0,001). Cuando se visualizó la señal hemorrágica, esta fue hiperecogénica a las 5 horas, 48 horas y 96 horas, volviéndose hipoecogénica al mes. Al analizar la ratio de la distancia de las cisternas subaracnoideas con respecto a la duramadre no se observaron diferencias significativas entre los animales de los grupos sanos y sham (p > 0,05). Sin embargo, se observó un aumento significativo en el lado ipsilateral de los animales con HIC (1,06 ± 0,04) con respecto a los animales sanos (0,99 ± 0,02, p=0,001) y sham (0,99 ± 0,04, p=0,004) a las 48 horas. Esta distancia también fue mayor en los animales con HIC (1,06 ± 0,04) con respecto a los sanos (0,99 ± 0,02, p=0,026) a las 96 horas. Las diferencias desaparecieron al mes (p > 0,05). Finalmente, al analizar, dentro del grupo de animales con HIC, el desplazamiento de las cisternas-duramadre, se obtuvieron los siguientes resultados: 0,03 ± 0,19 mm a las 5 horas, 0,21 ± 0,14 mm a las 48 horas, 0,13 ± 0,18 mm a las 96 horas y 0,08 ± 0,23 mm al mes. Este seguimiento también fue realizado por RM, donde se observó una reducción en el volumen de la HIC entre las 48 horas y el mes (71,86 ± 24,75 mm3 vs. 21,49 ± 9,74 mm3, p=0,001), así como también se observó en el hemisferio ipsilateral una mayor distancia de las cisternas-duramadre en el grupo de animales con HIC (1,06 ± 0,04) con respecto al grupo sano (0,98 ± 0,02, p=0,002) y sham (0,99 ± 0,03, p=0,008) a las 48 horas, como se ha comentado en el objetivo 2. Objetivo 4: Analizar la correlación del volumen de la hemorragia intracerebral, medido por ultrasonidos y por resonancia magnética, con la evaluación funcional. Cuando se analizó la evaluación funcional en los animales de los diferentes grupos experimentales, en el test de la barra, los animales con HIC mostraron un deterioro funcional significativo con respecto a los animales sanos a las 48 horas (4,64 ± 1,12 puntos vs. 0,00 ± 0,00 puntos respectivamente, p=0,001), 96 horas (3,45 ± 1,51 puntos vs. 0,20 ± 0,63 puntos, p=0,001) y al mes (2,18 ± 1,83 puntos vs. 0,00 ± 0,00 puntos, p=0,003). Este deterioro también se observó entre los animales con HIC frente los sham a las 48 horas (4,64 ± 1,12 puntos vs. 0,00 ± 0,00 puntos, p=0,001), 96 horas (3,45 ± 1,51 puntos vs. 0,00 ± 0,00 puntos, p=0,001) y el mes (2,18 ± 1,83 puntos vs. 0,00 ± 0,00 puntos, p=0,003). Cuando a los animales se les sometió al test de la barra con escalón, el grupo con HIC mostró mayor déficit funcional con respecto a los animales sanos a las 48 horas (93,89 ± 15,57 % vs. 20,08 ± 6,91 %, p=0,001), 96 horas (85,61 ± 21,70 % vs. 20,04 ± 9,42 %, p=0,001) y el mes (68,53 ± 23,24 % vs. 16,60 ± 8,27 %, p=0,001), así como también se observó mayor déficit funcional entre los animales con HIC y los sham a las 48 horas (93,89 ± 15,57 % vs. 23,70 ± 10,21 %, p=0,001), 96 horas (85,61 ± 21,70 % vs. 16,01 ± 8,27 %, p=0,001) y el mes (68,53 ± 23,24 % vs. 17,16 ± 7,31 %, p=0,001). El test de Rotarod mostró una peor coordinación motora en los animales con HIC comparado con los animales sanos a las 48 horas (51,82 ± 27,79 segundos vs. 91,63 ± 46,73 segundos, p=0,019) y 96 horas (68,88 ± 31,37 segundos vs. 98,00 ± 40,74 segundos, p=0,037), y con los animales sham a las 48 horas (51,82 ± 27,79 segundos vs. 107,00 ± 27,01 segundos, p=0,002) y 96 horas (68,88 ± 31,37 segundos vs. 107,57 ± 17,97 segundos, p=0,003). Finalmente, en el test de Rogers, los animales con HIC mostraron mayor déficit que los animales sanos a las 48 horas (3,54 ± 0,93 puntos vs. 0,60 ± 1,26 puntos, p=0,001), 96 horas (3,64 ± 0,81 puntos vs. 0,30 ± 0,95 puntos, p=0,001) y al mes (2,09 ± 1,81 puntos vs. 0,60 ± 1,26 puntos, p=0,041). Los animales con HIC también mostraron mayor déficit en este test con respecto a los animales sham a las 48 horas (3,54 ± 0,93 puntos vs. 0,60 ± 1,26 puntos, p=0,001) y 96 horas (3,64 ± 0,81 puntos vs. 1,10 ± 1,45 puntos, p=0,001). Además, el volumen de la HIC a las 48 horas, tanto por ultrasonidos como por RM, se correlacionó con los resultados al mes del test de la barra (ρ=0,860, p=0,001 y ρ=0,884, p=0,001 respectivamente), barra con escalón (ρ=0,755, p=0,007 y ρ=0,691, p=0,019) y Rotarod (ρ=0,909, p=0,001 y ρ=0,800, p=0,003). CONCLUSIONES Las conclusiones de este trabajo de tesis doctoral son las siguientes: 1. Los ultrasonidos demostraron utilidad en la visualización e identificación de las estructuras cerebrales en la rata. A través de la craneotomía total se observaron la corteza cerebral, el estriado, los ventrículos laterales, el tercer ventrículo, el acueducto cerebral y las cisternas subaracnoideas; a través de la craneotomía delimitada y el cráneo se observaron los ventrículos laterales y las cisternas subaracnoideas y, a través de la piel se observaron las cisternas subaracnoideas. Esto ha permitido la elaboración de un atlas anatómico en el que la resolución de las imágenes y las estructuras identificadas se incrementan a medida que se retiran las barreras de la ventana transcraneal. 2. Los ultrasonidos permiten la evaluación del volumen de la hemorragia y del desplazamiento de las estructuras cerebrales como consecuencia de la misma, con una precisión equiparable a la resonancia magnética. 3. Los ultrasonidos permiten monitorizar los cambios evolutivos que se producen en el volumen de la hemorragia intracerebral y el desplazamiento de las estructuras cerebrales. 4. El volumen de hemorragia, medido por ultrasonidos y resonancia magnética, presenta una excelente correlación con la evolución funcional demostrando resultados equiparables entre ambas técnicas de imagen.