Desarrollo y aplicación de estrategias (bio) analíticas para la evaluación de la toxicidad asociada a nanopartículas de plata en modelos in-vitro e in-vivo

Resumen

En la actualidad, las AgNPs, debido a su fuerte actividad antimicrobiana, se utilizan en una gran variedad de productos de consumo, así como en aplicaciones biomédicas, lo que provoca que tanto los seres humanos como el medio ambiente estén cada vez más expuestos a estas nanopartículas. Concretamente, el tamaño de las AgNPs es una de las propiedades más importantes y un factor crítico en lo que se refiere a toxicidad. Por ello, la presente Tesis Doctoral ha evaluado mediante el desarrollo y aplicación de diferentes estrategias analíticas y proteómicas la posible toxicidad de estas AgNPs en un sistema in vitro e in vivo dependiendo de su tamaño. En el campo toxicológico la proteómica en combinación con la espectrometría de masas juega un papel fundamental ya que permite identificar y cuantificar una gran cantidad de proteínas en muestras biológicas complejas. Por esta razón, uno de los objetivos de la presente Tesis Doctoral consiste en diseñar un estudio proteómico para estudiar la toxicidad de las AgNPs y ver cómo esta difiere según el tamaño de nanopartícula empleado. En primer lugar, se han llevado a cabo varios ensayos de caracterización, viabilidad e internalización celular. A continuación, se han implementado con éxito dos estrategias de proteómica cuantitativa: SILAC y super-­¿SILAC, en células HepG2 y en larvas de pez cebra, respectivamente, permitiendo así elucidar los mecanismos de toxicidad de dichas nanopartículas de forma diferencial. Los resultados obtenidos demuestran que el tamaño de las AgNPs puede inducir la activación de mecanismos biomoleculares únicos y, por tanto, efectos específicos que no serían activados por las mismas AgNPs de tamaño de partícula diferente. Asimismo, se confirma que las AgNP10, debido a su pequeño tamaño, son capaces de internalizar en el núcleo, producir estrés nucleolar y daño al ADN y, como consecuencia, activar mecanismos de reparación del ADN dañado. Con respecto al modelo in vivo, las proteinas alteradas fueron mayoritariamente estructurales en ambos casos, lo que justifica alteraciones morfológicas e histológicas observadas durante el desarrollo embrionario y celular de las larvas expuestas a las AgNPs. Al igual que en el modelo in vitro, la alteración observada fue más acusada cuando se expusieron las larvas a las AgNPs de menor tamaño, corroborando así su mayor toxicidad. Para complementar los estudios proteómicos realizados en el sistema in vivo, se utilizó la técnica LA-­¿ICP-­¿MS con el fin de conocer la diferente distribución de las AgNPs en función de su tamaño en las larvas de pez cebra ya que puede aportar informacion adicional sobre sus mecanismos de toxicidad. En primer lugar, fue necesario previamente desarrollar un método de calibración y semi-­¿cuantificación, el cual, se basó, principalmente, en la utilización de una gelatina de pescado como matriz similar a la muestra de interés enriquecida con Au (III) en disolución como patrón interno. Para ello, se optimizaron los parámetros más habituales de esta técnica. A continuación, se hizo un estudio de distribución de los tres metales en la muestra de interés mediante la obtención de imágenes aplicando los parámetros anteriormente optimizados. Las imágenes obtenidas mostraron una mayor acumulación de las AgNPs más pequeñas a lo largo de todo el cuerpo de la larva mientras que las de mayor tamaño se acumularon en mucha menor medida y sólo en el área de la cabeza, confirmando así que el patrón de distribución era diferente según el tamaño de las nanopartículas. La mayor acumulación de las AgNP10 en las larvas concuerda también con los estudios proteómicos realizados en los cuales se demostró una mayor alteración proteica en las larvas expuestas a AgNP10, debido posiblemente a una mayor acumulación de las mismas. De esta forma, se confirma que las AgNP10 producen una mayor toxicidad en el organismo al igual que ocurría en las células.