Nuevos elementos de reconocimiento molecular selectivo y métodos de amplificación para el desarrollo de (bio)sensores ópticosNew selective molecular recognition elements and amplification methods for the development of optical (bio)sensors

Resumen

Nuevos elementos de reconocimiento molecular selectivo y métodos de amplificación para el desarrollo de (bio)sensores ópticos Las micotoxinas son sustancias de bajo peso molecular producidas como metabolitos secundarios por una gran variedad de hongos filamentosos que pueden encontrarse como contaminantes naturales en muchos alimentos y piensos. La exposición a las micotoxinas puede deberse al consumo de alimentos contaminados, pero también a la inhalación de polvo que contiene esporas de hongos micotoxigénicos. Se calcula que cerca del 40% de los cultivos del mundo pueden estar contaminados con micotoxinas, de ahí que sea esencial el desarrollo de métodos analíticos que permitan detectar estas micotoxinas en los alimentos. Por otro lado, a pesar de su elevado riesgo en la calidad de los alimentos, varias micotoxinas presentan aplicaciones médicas, por ejemplo, como fármacos inmunosupresores para el trasplante de órganos. Sin embargo, una limitación para esta aplicación es la estrecha ventana terapéutica que presentan estos fármacos, por ejemplo, el ácido micofenólico. Por ello, también es de suma importancia controlar los niveles de estos compuestos en sangre para mejorar la eficacia clínica del inmunosupresor. La forma tradicional de analizar estas micotoxinas ha sido mediante métodos cromatográficos. Sin embargo, los biosensores e inmunoensayos han demostrado ser alternativas adecuadas para superar las limitaciones de las técnicas cromatográficas, ya que pueden proporcionar análisis rápidos, sensibles, baratos e incluso in situ. Esta tesis se ha centrado en el desarrollo de nuevos biosensores ópticos para el análisis de micotoxinas en alimentos y de fármacos inmunosupresores en sangre humana. Para lograr este objetivo, la tesis se dividió en dos partes. La primera parte de la tesis se centró en la selección de mimopéptidos de micotoxinas aplicando la tecnología de phage display. Los mimopéptidos se describen como péptidos imitadores de epítopos, ya que pueden unirse al mismo parátopo de anticuerpos que el antígeno correspondiente. La síntesis de conjugados de toxinas para su aplicación en inmunoensayos competitivos suele llevar mucho tiempo y suponer un reto, y puede dar lugar a moléculas inestables y reticuladas al azar que podrían reducir la sensibilidad del ensayo. En esta tesis se han realizado diferentes rondas de selección de phage display para tres micotoxinas diferentes: ácido micofenólico, ocratoxina A y alternariol, obteniendo resultados satisfactorios para la primera. En la segunda parte de esta tesis, se desarrollaron diferentes inmunoensayos basados en el uso de mimopéptidos. En primer lugar, el mimopéptido para el ácido micofenólico obtenido mediante phage display se utilizó para diseñar un inmunoensayo competitivo para la detección del inmunosupresor en suero humano unido a una proteína bioluminiscente, obteniendo un límite de detección de 0,26 ng mL¿1 y un IC50 de 2,9 ± 0,5 ng mL¿1. El biosensor mostró una buena selectividad hacia el MPA y se aplicó al análisis del fármaco inmunosupresor en muestras clínicas, tanto de pacientes sanos como tratados con MPA, seguido de una validación por cromatografía líquida acoplada a detección por matriz de diodos. En segundo lugar, se comparó el rendimiento analítico de un mimopéptido para la fumonisina B1, previamente descrito en bibliografía, fusionado con dos enzimas diferentes, la Gaussia luciferasa (A2-GLuc) y la NanoLuc luciferasa (A2-NLuc), para la determinación de la micotoxina en muestras de trigo. El ensayo que mostró el mejor rendimiento utilizó la proteína recombinante A2-NLuc, proporcionando un límite de detección de 0,61 ng mL¿1 y un rango dinámico de 1,9 a 95 ng mL¿1. Este ensayo se empleó para el análisis de la toxina en un material de matriz de referencia certificado, así como en muestras de trigo contaminadas de forma natural.