Desarrollo de un sistema “Point of Care” de diagnóstico molecular para la detección del Virus de la Hepatitis C mediante nanosondas-ADN

Resumen

Las enfermedades infecciosas causadas por virus son una de las principales amenazas actuales para la salud humana. En un mundo globalizado, factores humanos, animales y ecológicos son responsables de la rápida aparición de enfermedades emergentes y reemergentes. La mayoría de dichas enfermedades infecciosas son provocadas por virus ARN dada su alta tasa de mutación, que facilita su evasión a la respuesta inmune. Tal es el caso del virus de la Hepatitis C (VHC), un virus ARN que se transmite por contacto directo con la sangre de personas infectadas (VHC+). Se estima que 58 millones de personas presentan en la actualidad una infección crónica por VHC a nivel mundial, entre las cuales un alto porcentaje aún no han sido diagnosticadas y continúan contribuyendo a su transmisión. Actualmente, la prueba de referencia para detectar una infección activa por VHC es la RT-qPCR o reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa en tiempo real. Sin embargo, esta prueba requiere equipamiento y personal altamente especializado y además es costosa, lo que dificulta su accesibilidad a las poblaciones más vulnerables donde la prevalencia de VHC es más elevada. Con el fin de alcanzar el objetivo establecido por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el año 2030, de eliminar el VHC, una mejora en el acceso a sistemas de diagnóstico rápidos y sencillos es altamente necesaria. Teniendo en cuenta los requerimientos de refrigeración recomendados para el transporte de muestras de ARN, durante este trabajo se ha analizado la capacidad del muestreo en gota de sangre seca (DBS, dried blood spot) para preservar el ARN viral del VHC de muestras de sangre de pacientes VHC+. Se ha determinado que las tarjetas 903 Protein Saver® son un buen sistema de almacenamiento a largo plazo, al menos 9 meses y a temperatura ambiente, sin afectar a la integridad del ARN viral, para muestras de sangre de individuos VHC+. Esto convierte a las tarjetas 903 Protein Saver® en un método de muestreo recomendable para el diagnóstico y seguimiento de individuos VHC+ en lugares con pocos recursos. Con el objetivo de integrar los métodos diagnósticos actuales en dispositivos POC (Point of Care) o en el lugar de asistencia, la nanotecnología ha surgido como la gran alternativa. Durante este trabajo, se ha puesto a punto el protocolo de funcionalización de nanopartículas de oro coloidal de 20 y 50 nm de diámetro con sondas de ADN de cadena sencilla específicas frente al ARN viral del VHC, para la obtención de nanosondas diagnósticas. Las nanopartículas de oro tienen un característico color rojo en solución que, tras desestabilización en un tampón de elevada fuerza iónica, tornan a un tono violáceo o incluso incoloro, a causa de su agregación. Tras la optimización de las condiciones de detección, hemos determinado que la unión de nanosondas a dianas específicas del ARN viral del VHC permite su estabilización en un tampón de elevada fuerza iónica, manteniendo su coloración roja-rosácea inicial (máximo de absorbancia a λ = 522 – 540 nm). Por el contrario, en ausencia de diana específica, las nanosondas se desestabilizan en condiciones de elevada fuerza iónica, produciéndose un viraje de color de la solución a rosa pálido/incoloro, tras una incubación a 37oC durante 15 – 30 min (máximo de absorbancia a λ > 560 nm). Este viraje de color dependiente de la presencia de ARN viral de VHC ha permitido desarrollar un sistema de detección específico y colorimétrico. Con el objetivo de conseguir unos niveles de sensibilidad equiparables al diagnóstico de referencia por RT-qPCR, el sistema de detección con nanosondas se ha acoplado a un sistema de amplificación del ARN viral. Para ello, se optimizó la amplificación isotérmica mediada por bucle o amplificación LAMP (loop-mediated isothermal amplification), técnica que permite su implementación en condiciones POC. En las condiciones optimizadas, se consiguió una amplificación de ARN o ADNc de VHC tras incubación durante un máximo de 30 min a 65oC. Así, el sistema de diagnóstico desarrollado en esta Tesis Doctoral consiste en una plataforma Point of Care (POC) de bajo coste, que detecta el ARN de VHC en un tiempo total inferior a 60 min, mediante una amplificación isotérmica del material genético viral seguido de una lectura colorimétrica de los resultados a simple vista.