Análisis de compuestos orgánicos volátiles emitidos por muestras biológicas para el diagnóstico de tuberculosis bovina en jabalíes

Resumen

La tuberculosis bovina (TB) es una enfermedad que ha prevalecido pese a los esfuerzos de los distintos entes gubernamentales globales por erradicarla. La padecen tanto los animales domesticados como los salvajes, pudiéndose transmitir también a los humanos, a través del consumo de alimentos de animales infectados, del contacto con la sangre del animal infectado durante su sacrificio, o a través del aire exhalado por los animales infectados. Los métodos convencionales de identificación de tuberculosis bovina en animales vivos son invasivos. Éstos abarcan la prueba cutánea de tuberculina para el cribado, y la prueba cervical comparativa o el ensayo de liberación de interferón gamma como pruebas complementarias o de confirmación. El diagnóstico final implica el sacrificio del animal para analizar partes afectadas del organismo mediante la necropsia, realizando cultivo en muestras de tejidos. Después de sacrificar al animal, se han evidenciado muchos falsos positivos, lo que acarrea impactos muy negativos. El presente trabajo trata de la exploración y desarrollo de un método alternativo no invasivo que permita detectar de forma más sencilla y económica la enfermedad de TB en animales vivos. El estudio se efectuó sobre una población de jabalíes capturados en el Parque Nacional de Doñana, ubicado en Andalucía, España, un lugar con alta prevalencia de TB en múltiples especies silvestres. Los animales capturados fueron caracterizados por edad, sexo y localización de captura. Para el propósito de esta tesis doctoral se estudiaron muestras de compuestos orgánicos volátiles (COV) emitidos por el aliento y las heces de los animales. Para ello se desarrolló un método específico de recolección de las muestras, que se diseñó de modo que las muestras no fuesen contaminadas con compuestos volátiles del medio ambiente. Los COV emitidos por estas muestras fueron almacenados en tubos con material absorbente Tenax TA, los cuales fueron guardados en una nevera a 4 GRADOS C antes de su análisis. Una vez recogidas las muestras, los animales fueron sacrificados como parte del programa de vigilancia sanitaria del Parque Nacional de Doñana. A todos los animales se les aplicó la necropsia y se les extrajeron muestras de los lóbulos pulmonares y de los nódulos linfáticos, así como de otros tejidos que mostraron lesiones compatibles con la TB, para el análisis microbiológico e identificación de la infección por TB.Las muestras de COV se analizaron inicialmente por la técnica de cromatografía de gases acoplada a un cuadrupolo de tiempo de vuelo. Para el análisis de las muestras se evaluaron tres posibilidades: el empleo de un módulo automático de desorción térmica acoplado al cromatógrafo de gases, la medición del espacio de cabeza formado por los COV de las muestras dentro de un vial sellado, y la captura de los COV por medio de una fibra de microextracción en fase sólida (SPME), siendo ésta última la que mejores resultados arrojó. Asimismo, se optimizó la selección de la fibra de SPME y la configuración de los parámetros de operación del cromatógrafo de gases.Tras el análisis de las muestras, los COV que se encontraban inmersos en ellas, fueron identificados mediante el uso de la librería de espectros de masas NIST 14. Posterior a ello, se realizó un análisis estadístico entre los animales diagnosticados con TB y aquellos que resultaron negativos por TB, agrupado por tipo de muestra (aliento o heces) y grupo de edad de los animales, aplicando para ello la prueba t- test de Student. Este análisis, permitió la identificación de posibles biomarcadores volátiles de TB tanto en el aliento como en las heces, cuya posible fisiopatología se analizó en detalle en esta tesis doctoral.