Caracterització immunològica i patogènica de diferents aïllats de genotip i del virus de la síndrome reproductiva i respiratòria porcina

Resumen

En els països amb sistemes de producció industrial, la síndrome reproductiva i respiratòria porcina (SRRP) és un dels principals problemes sanitaris del sector porcí. Una de les característiques principals del virus causant d¿aquesta malaltia és l¿elevada variabilitat genètica, i probablement antigènica, que presenta cosa que resulta en una limitada eficàcia de les vacunes quan la soca vacunal i la infectant són genèticament allunyades. D¿altra banda, aquesta variabilitat condiciona el disseny i la interpretació dels estudis que es puguin realitzar per comprendre millor la interacció entre l¿hoste i el virus. Històricament, la majoria d¿estudis realitzats utilitzen una única soca per determinar les característiques del virus o la resposta de l¿hoste però cada cop és més evident que els resultats obtinguts amb una única soca del virus només es poden extrapolar de forma limitada a la comprensió general de la infecció. En estudis publicats prèviament, s¿havia descrit que el virus era capaç de replicar-se en diferents tipus de cèl¿lules dendrítiques i que aquesta replicació resultava en una alteració dels principals marcadors de superfície i de les citoquines secretades per aquestes cèl¿lules. Malgrat que la majoria d¿autors coincidien en afirmar que la replicació vírica podia afectar la capacitat de presentació d¿antigen de les CPA a través de la regulació de les proteïnes de superfície que intervenen en aquest procés, els resultats en quant a quins marcadors es modificaven o sobre quines citoquines es veien regulades eren sovint discordants. En el primer estudi d¿aquesta tesi es va caracteritzar el perfil de citoquines i els canvis d¿expressió en diferents molècules immunològicament rellevants en cèl¿lules presentadores d¿antigen (CPA) infectades amb diversos aïllats del genotip I del virus de la SRRP (n=39). Els resultats obtinguts en aquest estudi demostren en primer lloc que el sistema cel¿lular utilitzat per estudiar la interacció entre virus i CPA pot influir de forma significativa en el resultat. Així, la comparació de la resposta de citoquines induïda per diferents soques del virus de la SRRP en macròfags alveolars (MAP), cèl¿lules mononuclears de sang perifèrica (CMSP), cèl¿lules dendrítiques derivades de medul¿la òssia (CDMO) i cèl¿lules SwC3+(CD172a+) de sang perifèrica (SwC3+) mostra que mentre que la inhibició o manca de respostes d¿interferó alfa (IFN-¿) és un fet comú a totes les soques i tipus de cèl¿lules, les respostes i nivells d¿altres citoquines, particularment interleuquina 10 (IL-10) i factor de necrosi tumoral alfa (TNF-¿) difereixen, resultant les CDMO i les SwC3+ les cèl¿lules més sensibles en termes de producció de les esmentades citoquines en resposta al virus. En segon lloc, l¿estudi demostra que diferents aïllats tenen diferent capacitat d¿inducció de TNF-¿ i d¿IL-10 podent existir els quatre possibles fenotips resultants de la inducció o no d¿aquestes dues citoquines, des d¿IL-10-/TNF-¿- fins a IL-10+/TNF-¿+. A més, la capacitat d¿induir aquestes citoquines va lligada a la viabilitat del virus ja que la inactivació per calor fa desaparèixer la inducció d¿aquesta resposta. Per últim, en aquest primer estudi es va estudiar la regulació de diverses molècules de superfície involucrades en la presentació antigènica i en la maduració de les CDMO així com en la permissivitat al virus, incloent entre d¿altres SLA-I, SLA-II, CD80/86, CD163 i CD14. Els resultats obtinguts mostren que diferents aïllats del virus modulen de forma diferent aquestes molècules, però, en general es produeix un descens en l¿expressió de SLA-I i SLA-II podent existir una manca de balança entre l¿expressió de SLA-II i CD80/86. Així mateix, de forma genèrica, la infecció amb el virus sembla retardar la maduració de les CDMO com indica el manteniment d¿elevats nivells d¿expressió de CD14 en les cèl¿lules infectades comparativament a les de control. Finalment, l¿impacta de la infecció sobre CD163 sembla ser diferent en diferents soques. En el segon estudi es va seqüenciar el genoma complert de sis soques europees del virus de la SRRP, compreses també en el primer estudi, per tal de relacionar els possibles canvis observats amb la capacitat d¿induir IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 i TNF-¿. A més, en aquest estudi també es volia determinar si els canvis observats en el genoma tenien repercussions en els epítops B coneguts del virus. Els resultats obtinguts més rellevants d¿aquest estudi són: a) les regions més variables del virus són l¿ORF1a, l¿ORF3 i l¿ ORF4. Essent la proteïna no estructural 2 (nsp2), la regió més variable i on es concentren la majoria de delecions. b) els arbres filogenètics de les diferents soques varien en funció del segment del genoma que s¿utilitzi. Aquests resultats mostren que la nsp9 és la proteïna que millor reflecteix el genoma complert a l¿hora de construir els arbres filogenètics. c) els canvis genòmics de les diferents soques estudiades, semblen tenir conseqüències en els epítops B coneguts del virus. Dels nous epítops publicats fins el moment, només dos eren relativament conservats i set d¿ells tenien variacions substancials. A més, dos d¿aquests epítops no es trobaven en dues de les soques estudiades. En el tercer estudi, es caracteritzava la resposta immunitària homòloga i heteròloga de dues soques del virus de la SRRP. Per portar-lo a terme, es varen realitzar dues infeccions experimentals. En la primera d¿elles s¿inoculava la soca 3262 als animals i 84 dies després es re inoculaven amb aquesta soca o amb una altra soca, la 3267. En la segona, s¿immunitzaven els animals amb la soca 3267 i 84 dies després es reinoculaven amb aquesta mateixa soca o amb la soca 3262. Per tal de monitoritzar la resposta immune, s¿observava la clínica dels animals i es determinava la virèmia, la resposta humoral i la resposta cel¿lular mesurada en cèl¿lules productores d¿IFN-¿ . Alhora, es determinaren els nivells sèrics d¿IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-¿ i TGF-ß. Els resultats obtinguts mostren que la resposta immune generada per una soca no només ve determinada pel grau d¿homologia d¿aquesta soca sinó que les propietats intrínseques per generar una resposta òptima tenen un paper important. En la primera infecció, la soca 3262 induïa una virèmia relativament curta (¿28 dies), títols baixos d¿anticossos neutralitzants però una intensa resposta cel¿lular. En canvi, en el segon experiment, es va observar que la soca 3267 produïa virèmies llargues (fins 56 dies), títols elevats d¿anticossos neutralitzants i una resposta cel¿lular menor. Per contra, després dels desafiaments, aquesta soca (3267) conferia millor protecció donat que cap animal, ni en el desafiament homòleg ni en el del desafiament heteròleg desenvolupaven virèmia. Per últim, els resultats obtinguts en aquest estudi mostren que en la reinfecció homòloga de la soca 3267 indueix nivells substancialment elevats de TGF-ß mentre que això no succeeix per la soca 3262. Aquests resultats suggereixen la possible existència de mecanismes de regulació en funció de la soca.