Investigación del splicing del pre-ARNm en el mieloma múltipledesde su función en la patogenia a su abordaje terapéutico

Resumen

Los resultados de la tesis doctoral forman parte de tres trabajos originales publicados en revistas científicas indexadas en Science Citation Reports, que se resumen a continuación: Trabajo 1: El análisis del transcriptoma revela diferencias significativas entre los pacientes con leucemia de células plasmáticas primaria y con mieloma múltiple, que comparten un fondo genético similar Fundamento: La LCPp es una neoplasia poco frecuente y muy agresiva que continúa teniendo un pronóstico infausto. La deleción de 17p se ha observado en aproximadamente el 50 % de las LCPp, mientras que en el MM no excede el 10 % en el momento del diagnóstico. Aunque en el MM la deleción de 17p está asociada con mal pronóstico y enfermedad extramedular, su presencia no le confiere el grado de agresividad observado en la LCPp. El estudio de otros mecanismos que pudieran estar alterados diferencialmente en ambas discrasias, podría proporcionar nuevos datos sobre las singularidades biológicas entre estas dos entidades. Por ello, en este trabajo nos propusimos analizar el transcriptoma de la LCPp y del MM, en presencia de un fondo genético similar. Metodología: Los estudios del transcriptoma se llevaron a cabo en nueve muestras de pacientes con LCPp y 10 con MM. Las muestras fueron seleccionadas de manera que todas tuviesen deleción de 17p y una distribución homogénea del resto de alteraciones citogenéticas entre ambos grupos (deleción de 13q, t(11;14), t(4;14), t(14;16), ganancia de 1q y deleción de 1p). El estudio global del transcriptoma se realizó utilizando los microarrays HTAs 2.0 (human transcriptome arrays), partiendo del ARN total extraído de las muestras de LCPp y de MM. Se analizó también el estado mutacional del otro alelo de TP53 mediante secuenciación de Sanger. El análisis de los microarrays HTAs se llevó a cabo a tres niveles: expresión diferencial génica, expresión de transcritos y ocurrencia de eventos de splicing alternativo. Los resultados obtenidos se validaron mediante qRT-PCR. Resultados: La secuenciación de Sanger detectó mutaciones de TP53 en el 50 % de las muestras de LCPp y en el 30 % de los MM, localizadas la mayoría de ellas en el dominio de unión al ADN de p53 entre los exones 5 y 8, prediciendo una proteína inactiva. El análisis no supervisado de los HTAs de las 19 muestras permitió distinguir 2 grupos bien diferenciados, el de las LCPp y el de los MM, según la expresión génica. En cambio, el análisis no supervisado de los datos de RNA-seq de una serie de 73 pacientes con MM, pertenecientes al estudio CoMMpass (MMRF), que presentaban todos deleción de 17p no mostró ningún tipo de agrupamiento. Se encontraron 3 584 genes diferencialmente expresados entre las LCPp y los MM. La mayoría de ellos estaban infraexpresados (3 217 genes) en las LCPp en comparación con los MM. Entre las rutas de señalización afectadas se encontraba el spliceosoma, la síntesis de ARNs de transferencia y el procesamiento de proteínas en el retículo endoplasmático y transporte de ARN. El análisis a nivel de isoformas y de eventos de splicing mostró que había 20 626 isoformas desreguladas entre ambos grupos y que el evento de splicing más frecuente fue la inclusión o exclusión de exones. Además, se detectaron diferencias signifi cativas en la expresión de componentes de la maquinaria del spliceosoma entre las LCPp y los MM, tanto a nivel génico como a nivel de isoformas y de eventos de splicing. De hecho, un análisis de identifi cación de posibles sitios ESEs (exonic splicing enhancers) en la secuencia de exones desregulados entre la LCPp y el MM, mostró que más del 70 % de los exones tenían sitios ESEs de unión para las proteínas SRp40 y SC35, seguidas de SRp30a y SRp20. Los ensayos de qRT-PCR mostraron una correlación positiva estadísticamente significativa con los microarrays, a los tres niveles de análisis. Concretamente se confirmó que dos transcritos del gen IKZF1 estaban infraexpresados en las LCPp, a pesar de que la expresión génica total se mantuvo sin cambios significativos entre ambas discrasias. Conclusiones: Nuestros datos revelaron diferencias signifi cativas en la expresión de genes, isoformas y eventos de splicing entre la LCPp y el MM, en presencia de la deleción de 17p. Estos hallazgos resaltan la relevancia potencial del proceso de splicing del pre-ARNm y de la síntesis proteica en la patogénesis de la LCPp. Trabajo 2: La expresión de las isoformas proteicas de p53 predice la supervivencia de los pacientes con mieloma múltiple Fundamento: La pérdida de la actividad del gen supresor tumoral p53, a través de la deleción de 17p o de la mutación del gen, está asociada a una corta supervivencia en los pacientes con MM. Sin embargo, la desregulación de la vía de p53 abarca un espectro mucho más amplio de alteraciones. Actualmente se sabe que existen al menos 12 isoformas proteicas de p53 codificadas a partir de nueve isoformas de ARNm del gen TP53, como resultado de la combinación del splicing alternativo, el uso de promotores y/o sitios de inicio de la traducción alternativos. Las isoformas de p53 pueden agruparse en subclases dependiendo del mecanismo que dio lugar a su formación: subclase α, subclase β, subclase γ, subclase TA/Δ40, también llamadas isoformas largas, y subclase Δ133 o isoformas cortas. Aunque la desregulación de la expresión de las isoformas de p53 se ha asociado con el pronóstico en varios tipos de cáncer, hasta ahora no hay estudios que evalúen la expresión de las isoformas de p53 en el MM. Por ello, nos propusimos cuantificar la expresión de las isoformas de p53, tanto a nivel de proteína como de ARNm, en muestras de pacientes con MM, y analizar su valor clínico. Metodología: El estudio se llevó a cabo en 156 muestras de CPs CD138+ purificadas de pacientes con MM de nuevo diagnóstico, incluidos en un ensayo clínico del Grupo Español de Mieloma (PETHEMA/GEM2012). Para identificar y cuantificar la expresión de las isoformas proteicas de p53 se utilizó la tecnología de nanoinmunoensayo capilar. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: el anticuerpo monoclonal DO-11, cuyo epítopo está presente en el dominio de unión al ADN, y que permite por tanto la detección de todas las isoformas de p53 por su peso molecular; el anticuerpo monoclonal DO-1, cuyo epítopo está situado en el dominio de transactivación 1, sólo presente en las isoformas TA (TAp53α, TAp53β, y TAp53γ); el anticuerpo policlonal A300-249A-T, que es específico de las isoformas α (TAp53α, Δ40p53α, Δ133p53α, y Δ160p53α); y el anticuerpo policlonal KJC8, que es específico de las isoformas β (TAp53β, Δ40p53β, Δ133p53β, y Δ160p53β). El anticuerpo anti-GAPDH fue utilizado como control endógeno. Todos los datos de expresión de proteínas se analizaron mediante el programa Compass (ProteinSimple). La expresión del gen y de las isoformas de p53 a nivel de ARNm se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando oligonucleótidos diseñados, estandarizados y publicados previamente. Se cuantificaron las isoformas α, β, cortas (Δ133/Δ160) y largas (TA/Δ40), además del gen completo. Para analizar la presencia de mutaciones puntuales del gen TP53 se secuenciaron sus exones mediante NGS utilizando el método de captura. La estimación de las curvas de supervivencia se realizó mediante el método de Kaplan-Meier y su comparación con la prueba de log-rank. La prueba de χ2 y el test de Fisher se utilizaron para el análisis de asociación entre las variables categóricas. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo en los programas SPSS v.22.0, Simfi t v.7.5.1 y el paquete R. Resultados: El 76 % de los pacientes presentaban expresión de la proteína total p53: la mayor proporción correspondía a las isoformas largas, detectadas en el 72 % de las muestras, y una menor proporción correspondía a las isoformas cortas, sólo detectadas en el 18 % de los casos. Las isoformas TA se encontraron en el 85 % de los casos: la isoforma TAp53α fue más abundante que TAp53β y TAp53γ. El 15 % de los pacientes no presentaban, por tanto, expresión de las isoformas TA. Por su parte, las isoformas α y β se identificaron en el 85 % y el 52 % de los casos, respectivamente. Se detectó mayor expresión de las isoformas largas y de las TAp53β/γ en los pacientes que tenían deleción de 17p. En cambio, la proteína total y el resto de las isoformas no mostraron cambios en su expresión en función de la presencia de deleción de 17p. Además, los pacientes con MM que tenían alto riesgo citogenético expresaron niveles de expresión de TAp53β/γ más elevados que aquellos pacientes con riesgo citogenético estándar. El análisis de supervivencia puso de manifiesto que los pacientes con baja y alta expresión de isoformas cortas e isoformas TAp53β/γ, respectivamente, presentaban una supervivencia global (SG) y un tiempo hasta la progresión (TTP) más cortos. Cuando se analizó la supervivencia de los pacientes combinando el riesgo citogenético con la expresión de las isoformas, se observó que los pacientes con alto riesgo citogenético y alta expresión de las isoformas cortas o baja expresión de la isoforma TAp53β/γ, tuvieron una SG y TTP más largas, comparable a la de los pacientes con riesgo estándar. El mismo análisis considerando las alteraciones citogenéticas individualmente mostró un efecto beneficioso de la expresión de isoformas cortas en el pronóstico de los pacientes con t(4;14) o deleción de 17p. En el análisis multivariante, tanto el alto riesgo citogenético como los altos niveles de expresión de la isoforma TAp53β/γ se mantuvieron como factores pronósticos independientes del TTP. Conclusiones: Los cambios en la expresión de las isoformas proteicas cortas y las isoformas TAp53β/γ se asocian con el pronóstico de los pacientes con MM. La estratificación pronóstica de los pacientes basada en las alteraciones citogenéticas mejora notablemente cuando se incluyen los datos de expresión de las isoformas proteicas de p53. Trabajo 3: La amilorida, un antiguo diurético, es un agente terapéutico potencial para el mieloma múltiple Fundamento: El MM continúa siendo una enfermedad incurable. Los pacientes con MM se caracterizan por presentar sucesivas recaídas que son cada vez más resistentes a los fármacos administrados. Por lo tanto, a pesar de los avances en el conocimiento de su patogénesis y del desarrollo de fármacos dirigidos a mecanismos moleculares específicos, sigue siendo necesaria la investigación de otros agentes terapéuticos con actividad antitumoral para poder abordar las sucesivas recaídas. En este trabajo se analiza si la amilorida, un fármaco de tipo diurético aprobado para el tratamiento de la hipertensión y el edema asociado a la insuficiencia cardíaca, puede ser utilizado como una droga antimieloma. Metodología: Se utilizaron nueve líneas celulares de MM (NCI-H929, JJN3, KMS12-BM, KMS12-PE, RPMI-8226, U-266, MM1S, MM1R y RPMI-LR5), y 18 muestras de MO de pacientes con MM, para estudiar la citotoxicidad in vitro y el mecanismo de acción de la amilorida. La citotoxicidad de la amilorida ex vivo e in vivo, se evaluó en cuatro muestras de MO completas de donantes sanos y en un modelo murino de xenoinjerto de MM (65 ratones), respectivamente. La viabilidad y proliferación celulares se evaluaron mediante ensayos de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) y ensayos de CellTiter-Glo, y la muerte celular mediante citometría de flujo con doble marcaje con Anexina V y ioduro de propidio. La despolarización de la membrana mitocondrial y el ciclo celular se midieron mediante citometría de flujo utilizando un marcaje con DilC1(5) y con ioduro de propidio, respectivamente. La actividad de las caspasas 3/7, 8 y 9 se analizó mediante ensayos de luminiscencia. Se utilizó un panel de cinco anticuerpos para evaluar la citotoxicidad de la amilorida en las poblaciones celulares de MO, junto con el marcaje de anexina V [linfocitos T (CD3+), linfocitos B (CD19+), células NK (CD56+/CD3−), y granulocitos (SSChigh/CD45dim)]. Para evaluar la citotoxicidad de la amilorida en las CPs patológicas se utilizaron junto con el marcaje de anexina V tres marcadores, CD38, CD45 y CD56 o CD19, dependiendo del fenotipo específico de cada paciente. Los mecanismos de acción de la amilorida fueron investigados mediante experimentos de RNA-Seq, qRT-PCR, western blot y ensayos de inmunofluorescencia. Resultados: La amilorida provocó la muerte celular por apoptosis en el panel de líneas celulares de MM, así como en el modelo murino de xenoinjerto, sin toxicidad sistémica asociada al tratamiento. Los experimentos ex vivo utilizando muestras de MO de pacientes con MM, mostraron una disminución de la viabilidad celular de las células plasmáticas, sin afectar al resto de poblaciones celulares. Además, se observó un efecto sinérgico al combinar la amilorida con la dexametasona, el melfalán, la lenalidomida, y la pomalidomida. Curiosamente, las líneas celulares MM1R y RPMI-LR5, que son resistentes a la dexametasona y al melfalán, respectivamente, también fueron sensibles al tratamiento con la amilorida, de manera individual y en las combinaciones dobles (amilorida + dexametasona y amilorida + melfalán). Los experimentos de RNA-Seq mostraron un elevado número de isoformas, eventos de splicing alternativo y componentes de la maquinaria del spliceosoma alterados después del tratamiento con la amilorida. La inhibición de la viabilidad celular se detectó simultáneamente a la inhibición de la maquinaria del splicing, tanto in vitro como ex vivo e in vivo. La inducción de la apoptosis por la amilorida fue independiente de que p53 estuviese en su forma wt o mutado. Así, tanto las líneas celulares de MM con p53 wt como aquellas con p53 mutado mostraron una actividad transcripcional normal de p53, detectándose la activación de sus genes diana implicados en la inducción de la apoptosis. Sin embargo, en la línea celular que no presentaba expresión basal de p53, JJN3, no se detectó actividad transcripcional de p53. Conclusiones: Los resultados obtenidos demuestran una potente actividad antimieloma de la amilorida y proporcionan las bases preclínicas para considerar a la amilorida una alternativa terapéutica para los pacientes con MM refractarios o en recaída, especialmente para aquellos que presentan deleción o mutación de TP53.