Desarrollo de herramientas biotecnológicas en cianobacterias.Development of biotechnological tools in cyanobacteria

Resumen

Las cianobacterias se encuentran entre los organismos vivos más antiguos del planeta y se pueden hallar en todos los ecosistemas de la Tierra. Aparte de su papel ecológico en los ciclos globales del carbono y el nitrógeno, las cianobacterias se están convirtiendo en un chasis cada vez más atractivo en la producción biotecnológica de compuestos de alto valor añadido, pues los requerimientos para su crecimiento, luz y CO2, son mínimos, gratuitos y abundantes. Si bien diversas cianobacterias han sido ya caracterizadas para su aplicación industrial, muchas de ellas crecen en condiciones muy concretas de laboratorio. Por este motivo, continuamente se buscan nuevas cepas. Por otro lado, aunque cada vez se describen más, las herramientas moleculares de las que se dispone para modificar el metabolismo de las cianobacterias, aún son limitadas en comparación con las desarrolladas para otros microorganismos de uso industrial y biotecnológico. Con estos antecedentes, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral consistió en el aislamiento y caracterización de nuevas cianobacterias extremófilas, así como el desarrollo y optimización de diferentes herramientas moleculares para mejorar las aplicaciones de las cianobacterias. En primer lugar, se aislaron cianobacterias procedentes de un panel solar de la ciudad de Valencia con la idea de buscar cepas resistentes a radiación y a desecación para poder desarrollar distintas aplicaciones biotecnológicas. Debido a un mejor crecimiento, de entre todos los aislados se caracterizaron en el laboratorio cuatro cepas de Chroococcidiopsis, que se identificaron con el nombre de Chroococcidiopsis sp. Helios. Las diferentes cepas fueron capaces de crecer con concentraciones moderadas de NaCl, pH neutro y con diversas fuentes de nitrógeno y carbono. Por otra parte, las cepas Helios mostraron ser resistentes a UV-C y desecación, mejor que otras bacterias y cianobacterias de uso frecuente en el laboratorio. El análisis in silico de los genomas de las cuatro Chroococcidiopsis sp. aisladas reveló la presencia de genes implicados en la síntesis de pigmentos frente a UV, relacionados con la producción de trehalosa y el clúster responsable de la fijación de nitrógeno. Junto con las Chroococcidiopsis sp. Helios se escogieron otras cianobacterias y en todas ellas se evaluaron protocolos de transformación genética. Una de las cianobacterias de interés industrial escogida fue Arthrospira platensis PCC 9108, conocida comúnmente como espirulina. Se emplearon tanto plásmidos replicativos como casetes de ADN para integrarse en el genoma de la cianobacteria, transformados mediante conjugación con Agrobacterium tumefaciens, conjugación triparental con E. coli y electroporación. Por otro lado, se evaluó la funcionalidad de los plásmidos SEVA en diferentes géneros de cianobacterias: desde modelos de cepas industriales y de investigación como Synechocystis o Anabaena hasta extremófilos no modelo como Chroococcidiopsis, validando el uso de origen de replicación RSF1010. Posteriormente, estos plásmidos SEVA sirvieron de base para la expresión de yfp así como la aplicación de la tecnología CRISPR-Cpf1. Como prueba de concepto del potencial de los vectores pSEVA-Cpf1 creados, se aplicó con éxito en la eliminación del gen nblA en Synechocystis sp. PCC 6803. Finalmente, para incrementar el repertorio de herramientas disponibles en cianobacterias, se desarrollaron plásmidos integrativos y se validaron diferentes promotores constitutivos e inducibles para expresión heteróloga en la cepa de rápido crecimiento Synechococcus sp. PCC 11901. Además, se diseñó un sistema de degradación inducible y dirigida de proteínas que se ha ensayado y caracterizado empleando la YFP como proteína diana. El trabajo presentado en esta Tesis Doctoral demuestra el potencial biotecnológico de las cianobacterias. Las herramientas moleculares desarrolladas y descritas en esta Tesis Doctoral incrementarán el potencial biotecnológico de estos microorganismos.