Sinusoidal mechanobiology in advanced chronic liver disease

Resumen

Título: Mecanobiología sinusoidal aplicada a la enfermedad hepática crónica. Introducción: La cirrosis o enfermedad hepática crónica avanzada es actualmente la onceaba causa de muerte a nivel mundial con más de 1,2 millones de afectados anualmente. Las causas más comunes de esta enfermedad son el abuso de alcohol, las infecciones crónicas por el virus de la hepatitis o la esteatohepatitis asociada a una dieta y estilo de vida poco adecuados. El daño reiterado con estos agentes nocivos inducen la desregulación de las células del sinusoide hepático que, si persisten a lo largo de los años, conduce a una desregulación microcirculatoria y arquitectural hepáticas. A medida que progresa la enfermedad, ésta se manifiesta como un aumento en la resistencia vascular hepática al flujo portal que conlleva el desarrollo de hipertensión portal (HP). A nivel clínico, y en estadios más avanzados del síndrome, aparecen complicaciones derivadas de la HP como el sangrado por varices gastroesofágicas, la encefalopatía hepática o la ascitis entre otros. Hipótesis: En la presente tesis, se hipotetiza que las fuerzas físicas presentes en el microambiente sinusoidal, las cuales cambian durante el desarrollo de la cirrosis, juegan un papel clave en la desregulación sinusoidal y, en última instancia, a la perpetuación de la enfermedad. Objetivos: Los principales objetivos de esta tesis son el desarrollo de herramientas para el estudio de la mecanobiología sinusoidal a partir de los cuales explorar la influencia de 3 importantes factores mecanobiológicos alterados durante la progresión de la cirrosis: la arquitectura dinámica del sinusoide, la rigidez de la matriz y la presión hidrodinámica así como proponer nuevas terapias para paliar su influencia en la disfunción sinusoidal. Métodos: En esta tesis se presenta un protocolo para el aislamiento de las principales estirpes celulares del hígado en modelos preclínicos y la validación biológica de un dispositivo microfluídico que pretende mimetizar la arquitectura y hemodinámica hepáticas en un chip para la investigación preclínica. Utilizando estas metodologías, se han estudiado las ventajas del co-cultivo dinámico sobre las herramientas convencionales de mono-cultivo estático así como el efecto de la presión en el endotelio sinusoidal. Con el fin de analizar el efecto de la rigidez del sustrato, se han utilizado geles de poliacrilamida con rigidez variable mimetizando las propiedades mecánicas de un hígado sano, fibrótico o cirrótico. Para el estudio de estos factores se han utilizado cultivos primarios de las principales poblaciones hepáticas (hepatocitos, células endoteliales sinusoidales, células estrelladas y macrófagos hepáticos) aisladas de ratas sanas, de modelos preclínicos de cirrosis o en tejidos humanos. Principales resultados: El método de aislamiento 4 en 1 permite aislar los 4 tipos celulares mayoritarios del sinusoide hepático con alta pureza y funcionalidad tanto de modelos preclínicos sanos como de enfermedad hepática crónica. Por otro lado, el co-cultivo dinámico de dichas células (aisladas de hígados cirróticos o tejidos considerados como sanos) dentro del dispositivo desarrollado, mantienen su fenotipo y función mejor que los métodos de cultivo convencionales. A nivel de aplicación, demostramos que la respuesta hepatocitaria a fármacos descritos como hepatotóxicos es diferente en un cultivo 2D o en un modelo más fisiológico como el dispositivo descrito. Estas herramientas han sido utilizadas para el estudio de la mecanobiologia sinusoidal. El estudio de la rigidez de la matriz revela una implicación clave en la modulación del fenotipo sinusoidal. Células aisladas de ratas sanas (procedentes de un ambiente de baja rigidez) y cultivadas a alta rigidez se vuelven disfuncionales. Por el contrario, células aisladas de ratas cirróticas y cultivadas en matrices equivalentes a las de un hígado sano mejoran su funcionalidad. Utilizando el fármaco liraglutida, demostramos que su efecto antifibrótico es dependiente de la rigidez donde se encuentran las células. Finalmente, revelamos que la tensión entre el núcleo y el citoesqueleto juega un papel clave en la transducción de la señal desde que la célula siente la rigidez de la matriz hasta los cambios génicos y fenotípicos que se derivan como respuesta. Al estudiar el efecto de la presión hidrodinámica en el endotelio sinusoidal, describimos por primera vez que la presión patológica como la que experimentan los pacientes con HP es deletérea para las células endoteliales sinusoidales promoviendo su desregulación y disfunción. Además, identificamos un factor de transcripción como una molécula sensible a presión y proponemos la expresión de 2 de sus genes dianas como biomarcadores plasmáticos para detectar HP o HP clínicamente significativa en pacientes con enfermedad hepática crónica. Conclusiones: Los cambios mecanobiológicos que experimenta el microambiente sinusoidal a lo largo de la enfermedad hepática crónica (cambios en la arquitectura tridimensional i estímulo del flujo, el incremento en la rigidez hepática y la presión hidrodinámica) juegan un papel clave en la modulación del fenotipo sinusoidal y la perpetuación de la enfermedad.