Análisis funcional del gen MYOC en el pez cebraimplicaciones en la determinación sexual y en alteraciones oculares

Resumen

El gen MYOC es conocido principalmente por ser el primer gen implicado en glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA). El glaucoma es un conjunto de neuropatías ópticas caracterizadas por la muerte apoptótica progresiva de los axones de las células ganglionares de la retina, que pueden provocar una grave reducción del campo visual y ceguera. El gen MYOC consta de tres exones y codifica una glicoproteína de 504 aminoácidos llamada miocilina, con un peso molecular de 55-57 KDa y con una función biológica poco conocida. En el ojo, esta proteína está presente en el humor acuoso y en la matriz extracelular de la red trabecular. El glaucoma producido por mutaciones en el gen MYOC se caracteriza, generalmente, por un desarrollo juvenil y un gran aumento de la presión intraocular (PIO). Se cree que las variantes patogénicas conducen a una ganancia de función tóxica debido al plegamiento anómalo y la agregación intracelular de la proteína mutante. La mayoría de las mutaciones de MYOC que se han identificado en pacientes con GPAA están localizadas en su dominio olfactomedina carboxilo terminal, que está muy conservado filogenéticamente. A pesar de conocerse la participación del gen MYOC en esta patología desde hace más de 20 años, tanto el mecanismo patogénico como su función normal son todavía desconocidos. Así pues, el objetivo general de este trabajo fue analizar en profundidad la función fisiológica de este gen utilizando el pez cebra como modelo animal. Para ello, en primer lugar, se desarrolló una línea knock-out (KO) de myoc en el pez cebra mediante edición genómica con el sistema CRISPR/Cas9. Dicha línea es portadora de una variante que consistía en una deleción de 4 nucleótidos e inserción de 14 (c.236_239delinsAAAGGGGAAGGGGA), provocando un desplazamiento de la pauta de lectura y una pérdida de función de la proteína mutante debido a un codón prematuro de terminación p.(V75EfsX60). El análisis mediante PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) mostró una reducción significativa del 80% de la expresión del ARN mensajero (ARNm) de myoc en los peces homocigotos con respecto a los silvestres (WT, wild type). El análisis de expresión de miocilina mediante inmunohistoquímica fluorescente “in toto” de embriones silvestres completos a las 96 horas post-fecundación (hpf) mostró la presencia de la proteína en estructuras oculares del segmento anterior y en los músculos caudales. En adultos también se detectó en diferentes tejidos oculares y no oculares tales como músculo faríngeo, intestino, ovario y testículos. No se identificaron alteraciones macroscópicas ni microscópicas en los peces cebra homocigotos, no obstante, el fenotipo observado en esta línea fue la ausencia de hembras entre los animales adultos. El análisis transcriptómico de los peces KO de myoc mostró una expresión alterada de genes clave en la determinación del sexo masculino, indicando que miocilina es necesaria para la diferenciación de los ovarios en el pez cebra. Para continuar explorando su función, se generó mediante transgénesis mediada por el transposón Tol2 una línea de pez cebra Tg(actb1:myoc-2A-mCherry) que sobreexpresaba constitutivamente miocilina. Los ensayos de qRT-PCR mostraron un incremento de aproximadamente cuatro veces del ARNm de myoc en los embriones de pez cebra transgénicos (144 hpf) en comparación con los silvestres. Casi el 60% de los peces transgénicos de 2 años desarrollaron ojos agrandados con graves anomalías asimétricas y variables del segmento anterior, crecimiento displásico de la retina e hipertrofia del nervio óptico. El análisis de peces transgénicos de la generación F4, aunque no mostró alteraciones oculares significativas en larvas, confirmó la aparición de alteraciones oculares variables (sobrecrecimiento del iris y un engrosamiento del estroma corneal) a partir de los 13 meses de edad. La inmunohistoquímica de peces transgénicos de 2 años reveló una mayor presencia de miocilina en la mayoría de los tejidos oculares alterados, así como signos de gliosis retiniana y expansión de las células ganglionares y las fibras nerviosas, lo que indica que estas células contribuyeron a la displasia de la retina. Además, el ensayo TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling) mostró evidencias de apoptosis en las células ganglionares de la retina y en la capa externa del epitelio de la córnea, indicando la existencia de muerte celular. En todos los peces cebra transgénicos de 2 años se demostró la existencia de un deterioro visual. El análisis transcriptómico de los ojos transgénicos con alteraciones de estos peces mostró una expresión alterada de genes implicados en las vías relacionadas con el cristalino, músculos y matriz extracelular, entre otros procesos, mientras que el análisis de los ojos aparentemente normales mostró genes diferencialmente expresados implicados en metabolismo lipídico, sistema inmune y adhesión celular. En resumen, los resultados de este trabajo muestran que el pez cebra proporciona una nueva y potente herramienta para investigar la función de miocilina, aportando información sobre sus propiedades biológicas. Los estudios realizados apoyan la función de miocilina como una proteína matricelular que podría jugar un papel en la determinación del sexo del pez cebra, así como en la morfología del segmento anterior ocular y de la retina a través de la modulación de la organización de la matriz extracelular y la proliferación celular.