Respuesta de la levadura Saccharomyces cerevisiae al antifungico clotrimazolpapel de la ruta de integridad de la pared celular

Resumen

Las rutas de transducción de señales mediadas por MAPKs son esenciales para la adaptación y supervivencia de las células eucarióticas ante situaciones de estrés o nuevos estímulos externos. En la levadura Saccharomyces cerevisiae existen cinco rutas de MAPKs, entre las que destacan la de apareamiento, la de respuesta a elevada osmolaridad (HOG) y la de integridad de la pared celular (CWI), moduladas por las MAPKs Fus3 y Kss1, Hog1 y Slt2, respectivamente. La ruta CWI, que ejerce un papel fundamental en la respuesta de la levadura al daño en su pared celular, también es capaz de activarse en respuesta a otros estreses que no afectan directamente a esta estructura, como la temperatura elevada o el estrés oxidativo. Para la activación de la ruta CWI, es necesaria la acción de una serie de proteínas que actúan en cascada: la detección del estímulo por parte de los sensores (Wsc1, Mid1 y Mtl1), la transmisión de la señal hacia la GTPasa Rho1 a través de sus GEFs activadoras, la activación de la proteín quinasa Pkc1 y finalmente la activación del módulo de MAPKs, que culmina con la fosforilación de Slt2 en su motivo de activación conservado TEY. Posteriormente, Slt2 es capaz de regular mediante fosforilación a distintos sustratos con diferentes funciones, entre los que destacan los factores de transcripción Rlm1 y SBF. Nuestro grupo de investigación descubrió que el clotrimazol, un antifúngico empleado en clínica perteneciente a la familia de los imidazoles, era capaz de activar significativamente a la ruta CWI, por lo que decidimos estudiar en mayor profundidad la respuesta de la levadura a este fármaco a través de esta ruta de MAPKs. El tratamiento con el clotrimazol provocó una clara alteración de la señalización celular a través de las principales rutas de MAPKs de S. cerevisiae: produjo la activación de Hog1 y de Slt2, con la aparición de una forma de menor movilidad electroforética (LP-Slt2), y la reducción de la fosforilación de Kss1 y Fus3, efectos que se relacionaron con un incremento del estrés oxidativo en las células. La ruta CWI, y en menor medida la ruta HOG, son necesarias para el crecimiento de la levadura en presencia de este antifúngico. La activación de la ruta CWI fue inducida no solo a través del mecanismo de activación canónico mediado por Pkc1, sino también a través de un mecanismo alternativo capaz de activar al módulo de MAPKs. Asimismo, proteínas implicadas en otras rutas y procesos, como la subunidad catalítica de la PKA Tpk3 y la trehalosa-6-P sintasa Tps1, resultaron ser importantes para esta activación, especialmente para la generación de la forma LP-Slt2. Rlm1 y SBF se fosforilaron de forma dependiente a Slt2 en presencia del clotrimazol, pero esto no se tradujo en un aumento significativo de la actividad transcripcional de Rlm1. Por otro lado, se determinó que la forma LP-Slt2 propia del tratamiento con el clotrimazol se origina por la presencia de fosforilaciones adicionales a las del motivo TEY, y su aparición es dependiente de la activación previa de la MAPK y de su actividad catalítica. Además, se identificaron algunos residuos situados en la parte final de la zona C-terminal de Slt2 como implicados en estas fosforilaciones. Finalmente, un estudio global del fosfoproteoma de S. cerevisiae tras el tratamiento con el clotrimazol permitió determinar que este fármaco es capaz de inducir cambios en la fosforilación de un número significativo de proteínas. Atendiendo a los eventos de fosforilación, se detectaron 661 proteínas que se fosforilaron de forma dependiente del clotrimazol, de las cuales 258 debían su fosforilación a la presencia de Slt2. De este modo, se ha identificado la participación de esta MAPK en la regulación de las rutas CWI y HOG y de otros procesos celulares importantes.